Методы диагностики гельминтозов. Глава vii. методы диагностикипротозойных инвазий. Глава v. качественные методы исследования

Гельминтологические методы исследований . Методы диагностики гельминтозов разделяют на прямые, основанные на непосредственном выявлении самих гельминтов или их фрагментов, а также личинок и яиц гельминтов (методы исследования фекалий, мочи, желчи и дуоденального содержимого, мокроты, крови и тканей, материала, полученного при соскобе из перианальной области и подногтевых пространств), и косвенные, с помощью которых выявляют вторичные изменения, возникающие в организме человека в результате жизнедеятельности гельминтов (исследования морфологического состава крови, иммунологические методы диагностики гельминтозов, рентгенологические исследования и т.д.). Из прямых методов наиболее распространены копрологические, которые делятся на макро- и микрогельминтоскопические. В отдельных случаях используют специальные методы.

Макрогельмитоскопические методы исследования направлены на поиски гельминтов или их фрагментов (сколексов, члеников, частей стробилы цестод). Их применяют для диагностики тех гельминтозов, при которых яйца не выделяются с экскрементами больного или выделяются в небольшом количестве и не всегда (например, при энтеробиозе в фекалиях обнаруживают острицы, при тениидозах - членики).

Для обнаружения в фекалиях остриц или члеников цестод проводят просмотр фекалий невооруженным глазом. Для дифференциальной диагностики тениидозов рекомендуется просмотр разжиженных водой фекалий отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или в чашках Петри на темном фоне. Крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривают под лупой между двумя предметными стеклами. Если же по клиническим показаниям предполагают обнаружение мелких гельминтов или головок цестод после лечения, то подозрительные частицы рассматривают под лупой в капле глицерина, а в случае необходимости и под микроскопом.

Микрогельминтоскопические методы исследования (качественные) направлены на выявление яиц и личинок гельминтов. Применяют метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като. Смесь Като состоит из 6 мл 3% водного раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина и 500 мл 6% раствора фенола. Пластинки по Като (гидрофильный целлофан разрезают на части размером 20´ 40 мм ) погружают на 24 ч в смесь Като так, чтобы они прилегали друг к другу (3-5 мл раствора Като на 100 пластинок). 100 мг фекалий наносят на предметное стекло, накрывают целлофановой покровной пластинкой по Като и придавливают так, чтобы фекалии размазались по предметному стеклу в пределах целлофановой пластинки. Мазок оставляют при комнатной температуре для осветления на 40-50 мин, после чего просматривают под микроскопом. В жаркое время года во избежание высыхания препарата на пластинку приготовленного препарата кладут влажную губку.

Для полного выявления гельминтов всех видов метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като необходимо использовать в сочетании с одним из методов обогащения. Наиболее распространенными из них являются метод Калантарян и метод Фюллеборна.

Метод Калантарян: в склянках с широким горлом объемом 100 мл тщательно размешивают стеклянной палочкой 5 г фекалий, постепенно доливая насыщенный раствор нитрата натрия (1 кг азотнокислого натрия на 1 л воды при кипячении) до краев стакана. Всплывшие на поверхность крупные частицы удаляют бумажным совочком. К поверхности солевого раствора прикладывают предметное стекло (солевой раствор добавляют до полного соприкосновения смеси с предметньм стеклом). Через 20-30 мин предметное стекло снимают и пленку просматривают под микроскопом. При отсутствии данной соли можно использовать насыщенный раствор поваренной соли по Фголлеборну (400 г соли в 1 л воды при кипячении).

В связи с тем, что яйца, имеющие большой удельный вес (неоплодотворенные яйца аскарид, яйца трематод и крупных цестод), не всплывают, помимо исследования поверхностного слоя жидкости, при использовании метода Фюллеборна необходимо просмотреть под микроскопом 2-4 препарата из осадка.

Специальные лабораторные методы исследований на различные гельминтозы.

Исследование фекалий

Микроскопирование вначале проводят при слабом увеличении (Х80). Простейших можно заменить по более сильной преломляемости света, а некоторые виды - по их движению или изменению формы. Объект, замеченный при малом увеличении, рассматривают при увеличении 400 или 600. При отсутствии опыта просмотр мазков следует производить сразу при большом увеличении, что, однако, значительно увеличивает время на изучение препарата. Просмотр мазков при большом увеличении следует производить при более сильном освещении, регулируя его с помощью конденсора.

Дифференциальными признаками отдельных видов амеб в нативном мазке являются форма и размер тела, видимость ядра, характер образования псевдоподий, движение, деление цитоплазмы на экто- и эндоплазму, характер включений (фагоцитированные эритроциты и др.). При дифференцировке видов жгутиконосцев - размер и форма тела, количество жгутиков, характер передвижения, наличие или отсутствие ундулирующей мембраны. Специфическими признаками балантидиев являются размер, форма тела, движение, реснички, цитостом и др.

Основным отличительным признаком вегетативных форм простейших в живом состоянии служит движение. В мазках встречаются различного рода неподвижные образования - растительная клетчатка, мышечные волокна, споры, грибки и т.д. Они не должны приниматься во внимание при протозоологической диагностике.

Метод нативного мазка прост и доступен для любой лаборатории. Он позволяет при нахождении тканевых форм дизентерийных амеб с фагоцитированными эритроцитами поставить совершенно точный диагноз амебной дизентерии, а при обнаружении балантидиев и лямблий - диагноз балантидиаза и лямблиоза.

Окраска мазков раствором Люголя . Эта окраска применяется для диагностики простейших по цистам. Ею пользуются при исследовании оформленного, полуоформленного и кашицеобразного кала.

Для приготовления мазка конец деревянной палочки пачкается в фекалиях и обмывается в капле йодного раствора (J - 1,0 г, KJ - 2 г, дистиллированная вода - 100 мл), нанесенного на предметное стекло, до получения равномерной эмульсии. Препарат накрывают покровным стеклом и через 3 – 5 мин. микроскопируют. Мазок должен быть достаточно прозрачным для изучения его в проходящем свете.

Среди остатков непереваренной пищи, спор, грибков, йодофильных бактерий цисты простейших, окрашенные в коричневый или зеленовато-желтый цвет, выделяются строго определенной, характерной для каждого вида формой, размером, отчетливыми очертаниями краев, наличием гладкой, прозрачной, двухконтурной оболочки, содержимым цитоплазмы, а также наличием ядер с нечетко выраженной структурой. В цистах амеб заметны окрашенные в коричневый (темно-бурый) цвет гликогеновые вакуоли. Степень окраски этих вакуолей и очертания их границ варьируют в цистах простейших одного и того же вида в зависимости от их зрелости.

Гельминтозы человека - одна из самых распространенных групп заболеваний среди населения земного шара. При любом подозрении на заражение гельминтами необходимо сдать анализ на яйца глист. От правильности сбора материала зависит достоверность результатов, поэту важно знать особенности сдачи анализа.

Что обнаруживает анализ

Анализ кала на яйца глистов показывает заражение следующими гельминтами:

Вместе с анализом кала на яйцеглист часто назначается микроскопирование фекалий на цисты и вегетативные формы простейших микроорганизмов.

Это исследование проводится из того же материала. Оно позволяет выявить наличие цист и взрослых форм простейших в нижних отделах желудочно-кишечного тракта.

Когда требуется обследование

Направление на анализ кала на яйца глист дается при следующих обстоятельствах:

Сколько действует справка на яйцеглист? Результат исследования действителен 10 дней.

Как сдавать анализ правильно

От правильности сбора материала для исследования зависит достоверность результата и постановка правильного диагноза.

Какой-либо специфической подготовки не требуется. Достаточно перед тем, как сдать анализ соблюдать некоторые простые правила:

1. Кал нужно собрать в сухую, чистую, плотно закрывающуюся емкость. Специальные баночки под анализы можно приобрести в любой аптеке.
2. Перед актом дефекации нельзя мочиться, чтобы моча не попала в кал.
3. Собрать материал для исследования надо из разных частей каловых масс.
4. Перед забором кала нужно исключить прием слабительных средств, любых препаратов, влияющих на перистальтику кишечника, а также веществ, способных менять окраску фекалий. Нельзя применять лекарственные средства местного действия (свечи, крема, мази).
5. Женщинам нельзя сдавать анализ вовремя менструации.
6. Объем материала должен составлять 1-2 чайных ложки.

Хранить собранный анализ не рекомендуется. Лучше отнести его в лабораторию через 30-40 минут после сбора. Если это невозможно, то нужно поместить материал в холодильник при температуре 5-8 градусов. Хранить не более 8 часов. Чем больше пройдет времени от сдачи материала до доставки его на анализ, тем ниже его достоверность.

Нельзя забывать подписывать контейнеры с материалами на анализ. Приобрести тару можно в любой аптеке, или ее выдадут в лаборатории.

Правила забора материала на анализ для выявления цист и вегетативных форм простейших ничем не отличаются от приведенных выше.

Анализ на энтеробиоз

Из-за особенностей жизненного цикла остриц для диагностики энтеробиоза обычного анализа кала на яйца глистов бывает недостаточно. Тогда делают перианальный соскоб.

Соскоб - это метод обследования, когда материал для изучения получают из области анального отверстия.

1. Метод Грэхема. Суть - забор материала с помощью ленты с липким слоем. Она наклеивается в области ануса, через несколько секунд снимается. Яйца гельминта приклеиваются на ленту.
2. Соскоб по Рабиновичу. Для взятия препарата для исследования используются глазные стеклянные палочки с нанесенным на них специальным клеем для захвата яиц остриц.
3. Соскоб ватным тампоном. Чаще используется у взрослых.

Нельзя ходить в туалет (то есть совершать акт дефекации и мочится). Запрещены любые гигиенические процедуры: подмывание, подтирание салфеткой.

Забор делается в домашних условиях. Для этого применяют наборы, которые выдает врач, лаборатория, или они самостоятельно приобретаются в аптеке. Их два вида:

• со специальной пластиковой пробиркой;
• с предметным стеклом с наклейкой.

Алгоритм сбора набором со специальной пробиркой:

1. Вымыть руки.
2. Надеть латексные или целлофановые перчатки.
3. Палочкой, находящейся в пробирке провести по коже вокруг ануса.
4. Поместить палочку обратно в пробирку.
5. Плотно закрыть крышкой.
6. Выкинуть перчатки. Тщательно вымыть руки.
7. Доставить пробирку в лабораторию.

Алгоритм сбора набором с предметным стеклом:

1. Надеть перчатки.
2. Аккуратно отклеить ленту. Касаться клейкой части нельзя.
3. Наклеить вокруг анального отверстия.
4. Через 2-3 секунды отклеить.
5. Поместить ленту на предметное стекло.
6. Убрать в пакет.
7. Выкинуть перчатки и тщательно вымыть руки.
8. Доставить предметное стекло в лабораторию.

Методы выполнения анализа

Для развернутой гельминтоовариооскопии используют метод Като (метод «толстого мазка»). В нем применяют гидрофильный целлофан, которым накрывают мазок, а также раствор для осветления, состоящий из Малахитовой зелени, Глицерина и Фенола.

Исследование часто проводят с одним из методов обогащения:

• по Калантарян;
• по Фюллеборну.

Оба метода заключаются в удалении с помощью солевых растворов крупных частиц кала и осаживании яиц гельминтов в осадке. Таким образом, количество яиц в микроскопируемом содержимом увеличивается, и повышается вероятность их обнаружения.

Оценка результатов

Для предотвращения получения ложноотрицательных результатов при наличии симптоматики и эпидемиологического анамнеза обследования назначаются несколько раз с перерывом в несколько дней.

Как правильно собрать и сдавать анализы кала на яйца глист

Анализ кала на яйца глист – прямой способ для их определения. Можно выявить самих глистов и простейших их форм – цист, личинок и вегетативных форм. Если при обнаружении были обнаружены гельминты и простейшие их формы, дополнительные исследования назначаются в редких случаях.

Пренебрежение повторным анализом гарантирует то, что гельминтозы будут спокойно развиваться в организме.

Емкость для анализа

С процедурой взятия кала для анализа сталкивался каждый человек хотя бы один раз за свою жизнь. Произвести ее очень легко. Сама процедура несложная, однако есть ряд определенных правил, следование которым обеспечит более точный результат.

1. Анализ кала на глисты начинается с подготовки инструментов. Стерильная посуда – некритичное требование для того, чтобы сохранять стул. Специальные баночки можно приобрести в аптеке или подготовить их самостоятельно.
2. Чтобы сделать посуду стерильной, некоторые мамы ошпаривают ее кипятком. Для экономии средств испражнение можно поместить в обычную стеклянную баночку. Для этой цели подойдет даже пластмассовая посуда.
3. Чтобы обеспечить хорошую герметизацию, обязательное наличие крышек. Их всегда можно приобрести в аптеке, если нет желания мастерить что-то самому.
4. Аптечные емкости имеют в наборе ложечки. С их помощью помещают экскременты в емкость, что упрощает забор кала.
5. Некоторые поликлиники, проводящие анализ кала на яйца глист, выдают такие баночки бесплатно, взяв при этом плату за саму процедуру. В подобных емкостях спокойно можно хранить кал некоторое время до начала анализа.
6. Лаборатория не будет исследовать собранный стул, если он был принесен в коробках из картонной бумаги и подобных приспособлений.

Правила сдачи кала

Конечно, сделать это взрослому человеку легко, но даже такая простая процедура требует соблюдать правила сдачи.

1. Перед тем как сдавать кал, следует отказаться от приема слабительных средств, не делать клизм и не ставить свечи – это влияет на достоверность результата.
2. Собирающийся кал, который будет отправляться на анализ, не должен содержать в себе инородные жидкости – сточную воду, мочу, средства личной гигиены и любые другие выделения. Чтобы исключить попадание различных жидкостей, нужно использовать небольшой лоток.
3. Многие люди не знают, как правильно собрать кал, и делают ошибки. Материал на анализ собирается с различных участков. Готовое количество не должно превышать двух чайных ложек.
4. Лучше собрать анализ после того, как человек помочился. Особенно это касается маленьких детей.
5. У малышей собирать кал можно прямо из памперса.
6. Перед процедурой необходимо подготовить небольшую емкость с крышкой, после чего собрать кал, закрыть крышкой и подписать. Достаточно указать инициалы и дату забора.

Сдача и хранение

Лучше всего анализ делать в день сбора кала, но не все люди могут похвастаться регулярностью процесса. В отличие от мочи, кал годный более длительное время. Делают это с вечера – за сутки до исследования. Хранить кал на яйца глист можно только в закрытой емкости при температуре от 5 до 8 градусов.

В зимнее время подойдет хранение на подоконнике, а летом – в холодильнике. После этого доставка материала в лабораторию должна осуществиться как можно скорее.

Сколько делают анализ

Делается анализ кала в лаборатории. На изучение может понадобиться несколько дней. Готовый результат указывается на специальном бланке, который будет свидетельствовать о наличии или отсутствии глистов. После получения результатов больной готовится к дальнейшему исследованию.

Даже если при сборе кала на яйца глистов результат отрицательный, это не значит, что человек полностью здоров. В некоторых случаях личинок гельминтов не сразу получается обнаружить в испражнениях. Это объясняется тем, что яйца не всегда могут выходить с отходами.

В каких случаях может проводиться исследование

Рассмотрим, как сдавать анализы кала на яйца глист и в каких случаях это необходимо.

Энтеробиоз, который сопровождается следующими симптомами:

• слизь и кровь в испражнениях;
• позывы к рвоте;
• тошнота;
• боли в животе.

О чем говорит результат анализа

Срок действия анализа кала на яйца глист ограничен, поэтому важно провести процедуру вовремя и получить действительный результат. Расшифровка не вызывает трудностей – даже обычный человек может понять, каким оказался анализ. Лечащий врач делает на бланке указание «Обнаружено» или «Не обнаружено».

• круглые черви, вызывающие энтеробиоз;
• ленточные черви;
• нематоды.

Если результат оказался отрицательным, исследование кала на простейшие и яйца гельминтов повторяется еще 2 раза через каждые 4 дня. Только после этого можно рассматривать окончательный результат.

Особенности анализа

Аскаридоз

Исследование кала на простейшие и яйца гельминтов с помощью микроскопа свидетельствует о том, что болезнь находится в кишечной стадии. Кал на яйца глист, личинки которых находятся в мокроте, говорят о фазе миграции. Большое содержание в крови – повышенный уровень специфических антител.

Дуоденальное содержимое с яйцами аскарид – наличие гельминтов в панкреатических протоках.

Энтеробиоз

При анализе на энтеробиоз необязательно использовать каловый метод. Но как собрать при этом материал? На самом деле все очень просто: надо использовать специальную ватную палочку. Называется эта процедура соскобом перианальных складок. Энтеробиоз ставится в том случае, если в результате анализа были обнаружены яйца остриц.

Обнаружить яйца можно не сразу, поэтому анализ на яйцеглист проводят несколько раз подряд. Между процедурами должно пройти от 4 дней до недели.

Лямблиоз

Анализ кала на гельминты помогает выявить лямблий. После сдачи кала проводится повторное микроскопическое исследование.

Заключение

Мы подробно рассмотрели, как нужно сдавать анализ кала на яйца глистов. Процедура несложная, но это не значит, что можно забыть правила сбора. Не забывайте о том, сколько можно хранить фекалии перед исследованием.

Вы даже что-то читали о лекарствах, призванных победить заразу? И в этом нет ничего удивительного, ведь глисты смертельно опасны для человека – они способны очень быстро плодиться и долго жить, а болезни, которые они вызывают, проходят тяжело, с частыми рецидивами.

Плохое настроение, отсутствие аппетита, бессонница, дисфункция иммунной системы, дисбактериоз кишечника и боль в животе… Наверняка вы знаете эти симптомы не понаслышке.

Гельминтозы или глистные инвазии очень распространены среди населения. Согласно статистике, зараженность в западноевропейских странах достигает 50%, в России – 70%. Но наибольшая заболеваемость гельминтозами выявлена при выборочном обследовании населения юго-восточных и африканских государств, где она приближается практически к 100%.

Состояние здоровья у таких людей ухудшается: появляются симптомы различных хронических заболеваний – гастрита, гепатита, развивается анемия, аллергические реакции и другая патология. И сколько бы ни проводилось лечение, оно безуспешно, потому что не выявлена истинная причина болезни. Кроме того, они являются «ходячей инфекцией», подвергая опасности заражения других людей, особенно если в окружении есть ребенок.

Дети, ввиду своей активности и неосведомленности, быстро «подхватывают» инфекцию, не менее активно ее распространяют, и нередко тяжело заболевают. А таблетки от глистов для детей довольно часто бывают очень токсичными, вызывают побочные явления.

Поэтому выявление яиц глистов в кале, рано начатое лечение предупреждают как развитие осложнений гельминтоза, так и заражение окружающих. На основании результата анализа также подбираются глистогонные средства для людей в индивидуальном порядке.

Кому показано исследование на яйца глистов?

Исследование кала на заражение глистами проводится в 3-х случаях:

1. При подозрении на гельминтоз.
2. Профилактическое или «барьерное» обследование.
3. По желанию пациента.

Подозрение на гельминтоз

Заподозрить глистную инвазию (заражение) можно на основании следующих симптомов:

• нарушение работы кишечника (вздутие, запоры, поносы);
• неприятные ощущения в животе – урчание, покалывание;
• общая слабость, недомогание, плохой сон;
• повышенная нервозность, возбудимость, особенно у ребенка;
• бледность кожи;
• снижение веса;
• наличие аллергических высыпаний на коже и слизистых оболочках;
• ухудшение зрения.

«Барьерное» обследование

Согласно приказу Минздрава, это обследование обязательно должны проходить следующие категории людей:

• направляемые на работу в детские учреждения;
• оформляющиеся в предприятия общественного питания, торговую сеть, учреждения массового пребывания людей – санатории, интернаты, дома отдыха;
• идущие на работу в сферу коммунальных и бытовых услуг;
• оформляющиеся в медицинские учреждения – весь персонал, в косметологические и массажные кабинеты, фитнес-клубы, бассейны, парикмахерские;
• проходящие обследование для госпитализации, на операции, для санаторного лечения.

На всех лиц этих категорий оформляется санитарная книжка, куда вносятся результаты медицинского обследования, в том числе и на зараженность глистами. При его обнаружении допуск к работе запрещен до излечения и повторного обследования. Подобный анализ также нужно сдавать во время прохождения этими же категориями людей периодических медицинских осмотров.

Обследование по желанию пациента

Любой человек, допускающий вероятность заражения глистами, может обратиться для обследования и сдавать анализ. Например, если ему довелось побывать в местах с плохими санитарными условиями, в местах большого скопления людей, или же он прибыл из юго-восточных и африканских стран.

Совет: если у вас выявлены яйца глистов, до завершения лечения и контроля следует избегать посещения людных мест, продуктовых магазинов, баров, ресторанов, избегать контакта с ребенком. Будьте гуманны, заботьтесь о здоровье окружающих.

Какие виды гельминтов можно обнаружить в анализе кала?

• острицы (энтеробиоза);
• аскариды человеческой;
• власоглава (трихоцефалез);
• трематоды (описторхоз, фасциолез);
• ленточных червей (солитеров) – бычьего цепня, свиного цепня, гименолепидоза (карликового цепня), дифиллоботриоза (лентеца широкого).

Существует и множество других видов, не получивших большого распространения в наших широтах.

Как правильно собрать анализ?

Для правильного сбора анализа кала нужно соблюдать следующие требования:

Совет: далеко не всегда яйца глистов обнаруживаются с первого раза. Согласно правилам, проводится троекратное исследование с интервалом в 1 неделю, или же столько раз, сколько посчитает нужным врач.

Куда нужно обратиться, чтобы сдать анализ кала на обнаружение глистов?

Направить на обследование в лабораторию для выявления зараженности глистами может, в принципе, врач любой специальности. Взрослые, как правило, обращаются к терапевту, гастроэнтерологу или инфекционисту, в соответствии с жалобами. Ребенка направляет на исследование педиатр.

Анализ кала на яйца глистов – не единственное исследование, позволяющее выявить заражение. Но оно имеет место быть, с учетом высокой заболеваемости гельминтозами, и проводиться в строгом соответствии с правилами, а также с профилактической целью.

Видео

При обнаружении яиц гельминтов на различных объектах окру­жающей среды (почва, вода, овощи и др.) всегда необходимо опре­делять их жизнеспособность по внешнему виду, окрашиванием ви­тальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы, т.е.

Скармливанием лаборатор­ным животным.

Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду. Яйца гельминтов микроскопируют вначале при ма­лом, затем при большом увеличении. У деформированных и мерт­вых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плаз­ма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдви­нуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, ко­торые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней час­ти тела, по мере их гибели зернистость распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли - так называемые нитки жемчуга.

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власо­главов, остриц следует вызывать активные движения личинок лег­ким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жиз­неспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отсло­ившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце ли­чинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнару­живается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от места их нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зер­нистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются ва­куоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина 0,5 г, натрия бикарбоната 0,09 г, дистиллированной воды 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36-38 “С на 4 ч. При этом живые зародыши осво­бождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также раство­ряются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6-8 ч в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1 % раствор натрия сульфида, или 20 % раствор натрия гипохлорида, или же в 1 % раствор хлорной воды при 36-38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 сут. Незрелые и мертвые он­косферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем «растворяются» в течение 10 мин - 2 ч. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1 % раствора натрия хлорида, 0,5 % раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36- 38 °С.

Жизнеспособность сколексов эхинококков определяют при сла­бом нагревании. Для этого отмытые в воде сколексы или выводко­вые капсулы помещают в каплю воды на предметное стекло с лу­ночкой, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроско­пом с нагревательным столиком при температуре 38-39 °С. Если отсутствует нагревательный столик, препарат подогревают при помощи любого источника тепла. При этом жизнеспособные ско­лексы активно двигаются, сокращая или расслабляя присоски, уд­линяя и укорачивая хоботок. Если поместить сколексы в 0,5-1 % водный раствор филицилена при комнатной температуре, то все жизнеспособные сколексы быстро вывернутся и погибнут. Нежиз­неспособные сколексы при этом не вывертываются.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на расте­ниях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки тремато­ды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Жизнеспособность яиц карликового цепня определяют по распо­ложению крючьев на зародыше.

В живых яйцах карликового цепня происходят вялые маятнико­образные движения протоплазмы и почти незаметные раздвигания и сдвигания заостренных концов латеральной пары крючьев в сто­роны от средней пары.

Сокращения протоплазмы зародыша и зародышевых крючьев помогают зародышу освободиться сначала от оболочек онкосферы, а затем и от наружной оболочки яйца.

В живом яйце медианная пара и боковые пары крючьев распо­ложены параллельно, в некоторых яйцах лезвия боковых пар сбли­жены и расположены по отношению к средней паре крючьев под углом менее 45°.

Погибающий зародыш конвульсивно сокращается и вяло раздви­гает крючья. В погибшем зародыше движение крючьев прекраща­ется, и они располагаются в беспорядке, иногда же латеральные по отношению к соседней паре крючья бывают раздвинуты под пря­мым, тупым или острым углом.

Иногда наблюдаются сморщивание зародыша, образование зер­нистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5-10 до 38-40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых нематод следует изу­чать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3 % раствор формалина, приготовленный на изотоническом раство­ре натрия хлорида при температуре 24-30 °С, яйца власоглавов в 3 % раствор соляной кислоты при температуре 30-35 °С, яйца ост­риц в изотонический раствор натрия хлорида при температуре 37 “С. Чашки Петри следует открывать 1-3 раза в неделю для луч­шей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2-3 мес свиде­тельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гель­минтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых суток развивает­ся до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (вы­сотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из рав­ных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консис­тенции, осторожно наливают на дно цилиндра при помощи стеклян­ной трубки. В течение 1-2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25-30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личин­ки, а через 5-7 сут они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооружен­ным глазом. Естественно развивающиеся в воде яйца трематод, на­пример описторхов, дифиллоботриид, фасциол и др., помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают неболь­шой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол сле­дует учесть, что они быстрее развиваются в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22-24 °С через 9-12 сут формиру­ется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц тре­матод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету. При культивирова­нии воду меняют через 2--3 сут.

Личинки анкилостомид и стронгилоид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После нахождения в термостате при температуре 26-30 °С в течение 5-6 сут личинки расползают­ся по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий (метод Фюллеборна).

Метод Harada и Mori (1955). В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой бе­рут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровально# бумаге (15X150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Верхний конец накры­вают куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На про­бирке пишут номер и фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят в течение 8-10 сут при температуре 28 °С. Для изучения культуры снимают и удаляют целлофановую покрышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу филь­тровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под повер­хность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 мин, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а оса­док переносят на предметное стекло, накрывают покровным стек­лом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок не­обходимо пользоваться данными, представленными в табл. 13.

Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов. Мертвые тка­ни в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем жи­вые. Эти особенности используют в гельминтологии для определе­ния жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдель­ных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Таблица 13. Дифференциальная диагностика филярневидных личинок A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для дифференциального распознавания живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцируют метиле­новый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый си­ний в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают, зародыши мертвых яиц окрашива­ются в синий цвет.

Метод окрашивания неприменим для незрелых яиц аскарид и власоглавов; пигментированная оболочка прокрашивается, и поэтому не видно, окрасилась ли зародышевая клетка внутри яйца.

Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10 ООО осуществля­ют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жид­кости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Пре­парат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости, после чего этот же препарат просмат­ривают повторно через 2-3 ч. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 ч. Мертвые ли­чинки окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полно­стью).

Указывается на возможность окраски препаратов раствором йода при определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц. В ка­честве красителя в этом случае используют 5 % спиртовой раствор йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аска­ридий в течение 1-3 с окрашиваются в оранжевый цвет. Мертвые яйца описторха и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раство­ром толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10 000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают сафранином (в разведе­нии 1:10 000 10 % раствора спирта). Спирт удаляет краску с оболо­чек, а сафранин придает им красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет, зародыш у мертвых - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином либо в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000 или же индигокармином в разведении 1:1000-1:2000.

Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2-7 ч.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня ре­комендуется использовать следующие краски: 1) бриллианткрезиловый синий (1:8000) - через 1 ч у мертвых яиц особенно ярко окра­шивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бес­цветном фоне остального яйца; 2) сафранин: в разведении 1:8000 при воздействии в течение 2 ч и 1:5000 - в течение 3-5 ч; 3) 50 % ра­створ пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 ч при температуре 29-30 “С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

Живые плероцеркоиды лентеца широкого очень хорошо прокраши­ваются водным раствором (1:1000) нейтральрот в течение 5-20 мин. Для получения стойкой розовой окраски, не исчезающей в течение 5 сут и не влияющей на подвижность плероцеркоидов, обычно дос­таточно 10 мин. Степень окраски контролируют путем просмотра личинок в чистом изотоническом растворе натрия хлорида, для чего плероцеркоидов периодически извлекают из краски. Целесообраз­но применять метиленовый синий для окрашивания мертвых пле­роцеркоидов.

Р.Э.Чобанов и др. (1986) предложили методику определения жиз­неспособности яиц и личинок гельминтов с использованием в каче­стве красителя пигмента «рубрин», получаемого при культивиро­вании плесневого гриба Peniciliium rubrum. Для этого используют 3 % водный раствор красителя.

Процесс окраски яиц и личинок завершается через 1,5 ч. Нежиз­неспособные яйца остриц, бычьего и карликового цепней, анкило­стомид, трихостронгилид приобретают интенсивный розовый цвет, личинки анкилостомид и трихостронгилид - красный. Менее яр­кая окраска наблюдается у яиц аскарид и власоглавов, так как, выделяясь из кишечника, они уже имеют темно-коричневый цвет: Жизнеспособные яйца и личинки не окрашиваются.

Физико-химические методы стимуляции выхода мирацвдия из яиц трематод. Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физико­химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздей­ствием на яйца трематоды специальной реакционной среды в соче­тании с последовательными приемами - созданием перепада тем­ператур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.

Определение жизнеспособности яиц описторха по методу Герман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предвари­тельно охлаждают до 10-12 °С. Все последующие операции осуще­ствляют при комнатной температуре (18-22 °С). В центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержа­щей 100-400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5-10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осто­рожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. В пробир­ку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5-10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного све­тового микроскопа (Х200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка актив­но выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3-5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красите­лем, находящимся в среде. В итоге легко обнаруживают и подсчи­тывают мирацидии.

Приготовление реакционной среды. Среду готовят на 0,05 М трис- HCi буфере в оптимальных режимах pH 8,0-9,5. В буфер добавля­ют этанол до 10-13 % и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах pH) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит 1:50 000). Можно использовать и другой буфер, работаю­щий в щелочных пределах pH, например 0,05 М фосфатный (pH 8,5). Следовательно, среда содержит 96 % этанол - 12 частей; краситель (маточный раствор) - 1-10 частей; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96 % этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальное до 100 частей - 0,05 М трис-HCl буфер, pH 9,5.

Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Гер­ман, Беэра, Стратана. Каплю взвеси, содержащую 100-150 яиц тре­матоды, помещают в центрифужную пробирку на 1-2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипет­кой 1-2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28-30 °С 2-3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4 % раствора хлорида натрия или 0,3 % раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой на пред­метное стекло и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре (18-22 °С), при этом каждые 25-30 мин (по мере подсыхания) до­бавляют по 1-2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллиро­ванной воде. После этого препарат микроскопируют при 100-200- кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу рас­крывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3-7 % губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30-40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5-0,5 %). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1- 0,5 % (или хлорида калия в концентрации 0,05-0,4 %) обусловли­вает активность вышедшего мирацидия. В отличие от мелких про­зрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашенную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окраши­вания и подсчета мирацидиев.

Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов.

Впервые в гельминтологической практике методы люминесцентной микроскопии были применены в 1955 г. При этом сообщалось, что люминесцентная микроскопия дает возможность дифференциро­вать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюо­ресценции использовались не УФ-лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стекла­ми; к осветителю «ОИ-18» применялся специальный набор цветных фильтров.

Было установлено, что живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гель­минтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин,ауролин,сульфат берлерина, трипафлавин,риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц обо­лочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболоч­ка, а у мертвых и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет; у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридиновым оранжевым в разведении 1:10 ООО и 1: 50 ООО от 30 мин до 2 ч) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши этих яиц гельминтов излучают «горящий» оранжево-красный свет. Живые личинки ост­риц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают туск­лый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в «горящий» светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином - у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от ли­лово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не люминес­цируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый свет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки строн­гилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мерт­вые - ярко-оранжевым светом. Живые личинки трихинелл не светятся или дают слабое свечение при 10-минутной обработке ра­створами изотиоцианата флюоресцеина, аурамина и др. Флюорохромированные мертвые личинки (в концентрации 1:5000) дают яр­кое свечение.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресни­чек, но спустя 10-15 мин после гибели проявляются ярким «горя­щим» светло-зеленым, а затем оранжево-красным светом.

Материал для исследования: фекалии, моча, дуоденальное содержимое, мокрота, кровь, кожа, перианальный дендрит, мышечная ткань.

Микроскопические методы исследования основаны на обнаружении яиц и личинок гельминтов. В зависимости от целей исследования они делятся качественные и количественные.

1. Метод толстого мазка по Като. Принцип метода состоит в том, что яйца гельминтов обнаруживается в толстом мазке фекалий, просветленных глицерином и подкрашенных малахитовой зеленью. Метод более всего эффективен при аскаридозе, трихоцефалезе, дифиллоботриозе , тениидозах и в меньшей степени- при анкилостомидозах и карликовом цепне.

3. Метод обогащения (Кофоида - Барбера) основан на принципе всплывания яиц в насыщенном растворе поваренной соли. Можно обнаружить яйца трематод, широкого лентеца, онкосферы, тениды, неоплодотворенные яйца аскарид.

4. Метод Калантарян - принцип тот же, что и при предыдущем, но в качестве флотационного раствора используют насыщенный раствор азотистой селитры.

5. Существуют специальные методы исследования фекалий на наличие фасцилеза, стронгилоидоза, анкилостомидоза.

6. Прианальный и перианально-ректальный метод диагностики энтеробиоза. Соскоб делают утром (до туалета и дефекации) или вечером во время сна.

Очень важно знать