Примеры генных заболеваний определяемых биохимическим методом. Методы генетики. Методы генетики человека

Биохимические методы направлены на выявление биохимического фенотипа организма. Эти методы позволяют диагностировать наследственные болезни, обусловленные генными мутациями. Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов внутри клетки) отражают сущность болезни более адекватно, чем клинические симптомы. С помощью биохимических методов описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ. Наиболее распространенными среди таких заболеваний являются болезни, связанные с дефектами ферментов, структурных и транспортных белков. Дефекты ферментов устанавливают путем определения содержания в биологических средах (например, моче и крови) продуктов метаболизма, являющихся продуктом функционирования данного белка.

Дефицит конечного продукта, сопровождающийся накоплением промежуточных и продуктов нарушенного метаболизма, свидетельствует о дефекте фермента или его дефиците в организме. Биохимические методы многоступенчаты. Для их проведения требуется аппаратура разных классов. Объектами биохимической могут быть моча, пот, плазма и форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты). В связи с многообразием биохимических методов, применяемых в лабораторной диагностике наследственных болезней, для эффективного их использования применяется определенная система. Биохимическую диагностику проводят в два этапа. На первом этапе отбирают предположительные случаи заболеваний, на втором — более точными и сложными методами уточняют диагноз заболевания. Первый этап включает качественные и количественные тесты с мочой и кровью на белок, кетокислоты, цистин и гомоцистин, креатинин и другие показатели. Фактически такие исследования можно проводить в каждой больнице. Показания их применения достаточно широкие, стоимость каждого анализа невысокая. Второй этап основан на более точных методах, позволяющих обнаружить большие группы биохимических аномалий. Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать нарушения обмена аминокислот, олигосахаридов и гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Газовая хроматография применяется для выявления наследственных болезней обмена органических кислот.

С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий. Несмотря на сложность и дороговизну, биохимическим методам принадлежит ведущая роль в диагностике моногенных наследственных болезней. Современные высокоточные технологии (жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, магнитная резонансная спектроскопия, бомбардировка быстрыми нейтронами) позволяют идентифицировать любые метаболиты, специфические для конкретной наследственной болезни. Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорожденных являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, нарушения кислотно-основного состояния, остановка роста. Например, в случае фенилкетонурии применение биохимических исследований позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия. У детей биохимические методы используются во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, специфическая для какой-либо болезни клиническая картина). Биохимические методы применяются для диагностики наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная дегенерация, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы).

23.Биохимический метод, его сущность, возможности применения при медико-генетическом консультировании.

Биохимические методы.

Эти методы используются для диагностики болезней обмена веществ, причиной которых является изменение активности определенных ферментов. С помощью биохимических методов открыто около 500 молекулярных болезней, являющихся следствием проявления мутантных генов. При различных типах заболеваний удается либо определить сам аномальный белок-фермент, либо промежуточные продукты обмена. Эти методы отличаются большой трудоемкостью, требуют специального оборудования и потому не могут быть широко использованы для массовых популяционных исследований с целью раннего выявления больных с наследственной патологией обмена.

В последние два десятилетия в разных странах разрабатываются и применяются для массовых исследований специальные программы.

Первый этап такой программы состоит в том, чтобы среди большого количества обследуемых выделит предположительно больных, имеющих, какое-то наследственное отклонение от нормы. Такая программа называется просеивающей, или скриннинг-программой (англ. screening - просеивание). Для этого этапа обычно используется небольшое количество простых, доступных методик (экспресс-методов). Экспресс-методы основаны на простых качественных реакциях выявления продуктов обмена в моче, крови.

На втором этапе проводится уточнение (подтверждение диагноза или отклонение при ложно-положительной реакции на первом этапе). Для этого используются точные хроматографические методы определения ферментов, аминокислот и т. п.

Применяют также микробиологические тесты, они основаны на том, что некоторые штаммы бактерий могут расти только в средах, содержащих определенные аминокислоты, углеводы. Удалось получить штаммы по веществам, являющимся субстратамиили промежуточными метаболитами у больных при нарушении обмена. Если в крови или моче есть требуемое для роста вещество, то в чашке Петри вокруг фильтровальной бумаги, пропитанной одной из этих жидкостей, наблюдается активное размножение микробов, чего не бывает в случае анализа у здорового человека. Разрабатываются различные варианты микробиологических методов.

Биохимические, иммунологические и другие параклинические методы не являются специфичными для генетической консультации, но применяются так же широко, как и при диагностике ненаследственных болезней. При наследственных болезнях часто возникает необходимость применять те же тесты не только у пациента, но и других членов семьи (составление биохимической или иммунологической "родословной")

24.Близнецовость у человека, критерии определения идентичности близнецов. Близнецовый метод в генетическом анализе.

Близнецы- дети одной матери, резвившиеся в течение одной беременности и появившиеся на свет в результате одних родов практически одновременно. Близнецы могут быть как однополые, так и разнополые.

Выделяют два основных типа близнецов:

монозиготные (гомозиготные);

дизиготные (гетерозиготные).

Монозиготные (однояйцовые, гомозиготные или идентичные) близнецы образуются из одной зиготы (одной яйцеклетки, оплодотворенной одним сперматозоидом), разделившейся на стадии дробления на две (или более) части. Они обладают одинаковыми генотипами. Монозиготные идентичные близнецы всегда одного пола и обладают очень большим портретным сходством.

Дизиготные близнецы развиваются в том случае, если две яйцеклетки оплодотворены двумя сперматозоидами. Естественно, дизиготные близнецы имеют различные генотипы. Они сходны между собой не более, чем братья и сестры, так как имеют около 50 % идентичных генов.

Общая частота рождения близнецов составляет примерно 1 %, из них около 1/3 приходится на монозиготных близнецов.

Для подтверждения монозиготности близнецов, используют ряд подходов:

сравнение по многим, главным образом, морфологическим признакам - пигментация глаз, волос и кожи, особенности волосяного покрова на голове и теле, а также форма волос, форма ушей, носа, губ и ногтей, пальцевые узоры (полисимптомный подход);

сравнение по эритроцитарным антигенам – группы крови АВО, резус, MN и др., по белкам и сыворотки крови: все перечисленные маркеры относятсяк категории моногенных менделирующих признаков, а контролирующие их гены отличаются узкой нормой реакции (иммунологический подход);

сравнение данных ЭКГ и ЭГ- электрокардиографии и энцефалограмм - близнецов (клинико-функциональный метод);

трансплантационный тест, заключающийся в перекрестной пересадке кожи у близнецов (вариант иммунологического подхода, успешная перекрестная пересадка – наиболее достоверный критерий монозиготности).

Близнецовый метод используется для выяснения наследственной обусловленности признаков и хорошо демонстрирует взаимоотношения между генотипом и внешней средой. С помощью этого метода удалось оценить значимость генетической предрасположенности к многим заболеваниям, пенетрантность, экспрессивность и условия проявления тех или иных видов патологии. Близнецовые данные оказываются полезными для количественной оценки степени генетической детерминированности отдельных признаков, в связи с чем, близнецовый метод можно считать одним из важных методов количественной генетики.

Таким образом, близнецовый метод позволяет количественно оценить вклад наследственности (генотипа) и вклад окружающей среды в развитие изучаемого признака (болезни).

Близнецовый метод включает следующие этапы:

Этап 1. Подбор пар монозиготных и дизиготных близнецов.

Подбирают по 100 пар близнецов, у которых хотя бы у одного из двух близнецов имеется изучаемый признак

Этап 2. Вычисление степени сходства внутри каждой группы близнецов.

Определяются отдельно для каждой группы

Конкордантность(К) – наличие признака одновременно у обоих близнецов.

Дискордантность(Д) – наличие признака только у одного близнеца из пары.

Коэффициент наследуемости H

Мз- монозиготные

Дз- дизиготные

Формула Хольцингера

Н- коэффициент наследуемости

Е- доля среды в формировании изучаемого признака

Этап 3 Вычисление доли генотипа и доли среды в развитии изучаемого признака

Если НЕ преобладает влияние наследственности

Если НЕ определяющим фактором является средовой.

С помощью биохимических методов изучают наследственные заболевания, обусловленные генными мутациями, и полиформизм по нормальным первичным продуктам генов. Впервые эти методы генетики человека стали применять в начале ХХ в. В последнее время их широко используют в поиске новых форм мутантных аллелей. С их помощью описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ. Для многих из них выявлен дефект первичного генного продукта.

Биохимическую диагностику наследственных нарушений обмена проводят в 2 этапа. На первом этапе отбирают предположительные случаи заболеваний, на втором – более сложными и точными методами уточняют диагноз заболевания. Применение биохимических исследований для диагностики заболеваний в пренатальном периоде или непосредственно после рождения позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия.

Транскрипционые факторы - белки, взаимодействующие с определёнными регуляторными сайтами и ускоряющие или замедляющие процесс транскрипции. Соотношение информативной и неинформативной частей в транскриптонах эукариотов составляет в среднем 1:9 (у прокариотов 9:1).Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК. Разделение ДНК на множество транскриптонов позволяет осуществлять с разной активностью индивидуальное считывание (транскрипцию) разных генов.

В каждом транскриптоне транскрибируется только одна из двух цепей ДНК, которая называется матричной, вторая, комплементарная ей цепь, называется кодирующей. Синтез цепи РНК идёт от 5"- к З"-концу, при этом матричная цепь ДНК всегда антипараллельна синтезируемой нуклеиновой кислоте

Посттранскрипционные модификации первичноготранскриптатРНК (процессинг тРНК)

ПервичныйтранскрипттРНК содержит около 100 нуклеотидов, а после процессинга - 70-90 нуклеотидньгх остатков. Посттранскрипционные модификации первичныхтранскриптовтРНК происходят при участии РНК-аз (рибонуклеаз). Так, формирование 3"-конца тРНК катализирует РНК-аза, представляющая собой 3"-экзонуклеазу, "отрезающую" по одному нук-леотиду, пока не достигнет последовательности -ССА, одинаковой для всех тРНК. Для некоторых тРНК формирование последовательности -ССА на 3"-конце (акцепторный конец) происходит в результате последовательного присоединения этих трёх нуклеотидов. Пре-тРНК содержит всего один интрон, состоящий из 14-16 нуклеотидов. Удаление интрона и сплайсинг приводят к формированию структуры, называемой "антикодон", - триплета нуклеотидов, обеспечивающего взаимодействие тРНК с комплементарным кодоном мРНК в ходе синтеза белков

Посттранскрипционные модификации (процессинг) первичноготранскриптарРНК. Формирование рибосом

В клетках человека содержится около сотни копий гена рРНК, локализованных группами на пяти хромосомах. Гены рРНК транскрибируются РНК-полимеразой I с образованием идентичныхтранскриптов. Первичныетранскрипты имеют длину около 13 000 нуклеотид-ных остатков (45S рРНК). Прежде чем покинуть ядро в составе рибосомной частицы, молекула 45 S рРНК подвергается процессин-гу, в результате образуется 28S рРНК (около 5000 нуклеотидов), 18S рРНК (около 2000 нуклеотидов) и 5,88 рРНК (около 160 нуклеотидов), которые являются компонентами рибосом (рис. 4-35). Остальная часть транскрипта разрушается в ядре.

Генеалогический метод генетики человека. Основные правила составления и последующего анализа родословных схем (на примере собственной семейной родословной схеме). Значение метода в изучении закономерностей наследования признаков.

Методы генетики человека

Для генетических исследований человек является неудобным объектом, так как у человека: невозможно экспериментальное скрещивание; большое количество хромосом; поздно наступает половая зрелость; малое число потомков в каждой семье; невозможно уравнивание условий жизни для потомства.

В генетике человека используется ряд методов исследования.

Генеалогический метод

Использование этого метода возможно в том случае, когда известны прямые родственники - предки обладателя наследственного признака (пробанда) по материнской и отцовской линиям в ряду поколений или потомки пробанда также в нескольких поколениях. При составлении родословных в генетике используется определенная система обозначений. После составления родословной проводится ее анализ с целью установления характера наследования изучаемого признака.

Условные обозначения, принятые при составлении родословных:

1 - мужчина; 2 - женщина; 3 - пол не выяснен; 4 - обладатель изучаемого признака; 5 - гетерозиготный носитель изучаемого рецессивного гена; 6 - брак; 7 - брак мужчины с двумя женщинами; 8 - родственный брак; 9 - родители, дети и порядок их рождения; 10 - дизиготные близнецы; 11 - монозиготные близнецы.

Благодаря генеалогическому методу были определены типы наследования многих признаков у человека. Так, по аутосомно-доминантному типу наследуются полидактилия (увеличенное количество пальцев), возможность свертывать язык в трубочку, брахидактилия (короткопалость, обусловленная отсутствием двух фаланг на пальцах), веснушки, раннее облысение, сросшиеся пальцы, заячья губа, волчья пасть, катаракта глаз, хрупкость костей и многие другие. Альбинизм, рыжие волосы, подверженность полиомиелиту, сахарный диабет, врожденная глухота и другие признаки наследуются как аутосомно-рецессивные.

Целый ряд признаков наследуется сцепленно с полом: Х-сцепленное наследование - гемофилия, дальтонизм; Y-сцепленное - гипертрихоз края ушной раковины, перепончатость пальцев ног. Имеется ряд генов, локализованных в гомологичных участках Х- и Y-хромосом, например общая цветовая слепота.

метод анализа родословных, является наиболее фундаментальным и универсальным методом изучения наследственности и изменчивости человека. Он заключается в изучении какого-либо нормального или чаще патологического признака в поколениях людей, которые находятся друг с другом в родственных отношениях. Генеалогический метод опирается на генеалогию – учение о родословных. Сутью генеалогического метода является составление и анализ родословных. Генеалогический метод соответствует основному методу генетики - гибридологическому методу, который был впервые разработан Г. Менделем. Но в отличие от него исследователи не подбирают родительские пары для целенаправленного скрещивания, а лишь детально анализируют результаты процесса естественной репродукции людей. Анализу по изучаемому признаку подвергается одна или несколько десятков семей с многочисленными родственниками разных поколений. Использование большого количества семей отчасти компенсирует низкую плодовитость человека и увеличивает число изучаемых потомков.

Похожая информация.

Причиной многих врожденных на­рушений метаболизма являются различные дефекты ферментов, возника­ющие вследствие изменяющих их структуру мутаций. Биохимичские по­казатели (первичный продукт гена, на­копление патологических метаболитов внутри клетки и во всех клеточных жидкостях больного) более точно от­ражают сущность болезни по сравне­нию с показателями клиническими, поэтому их значение в диагностике на­следственных болезней постоянно воз­растает. Использование современных биохимических методов (электрофо­реза, хроматографии, спектроскопии и др.) позволяют определять любые ме­таболиты, специфические для кон­кретной наследственной болезни.

Предметом современной биохими­ческой диагностики являются специ­фические метаболиты, энзимопатии, различные белки.

Объектами биохимического анализа могут служить моча, пот, плазма и сы­воротка крови, форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты).

Для биохимической диагностики ис­пользуются как простые качественные реакции (например, хлорид железа для выявления фенилкетонурии или динитрофенилгидразин для выявления кетокислот), так и более точные методы

Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать нарушение обмена аминокислот, олигосахаридов, мукополисахаридов. Газовая хроматография применяется для выявления наруше­ний обмена органических кислот и т.д.

Показаниями для использования биохимических методов у больных с наследственным нарушением обмена веществ являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, желтуха, специфический запах мочи и пота, ос­тановка роста, нарушение физического развития, непереносимость некото­рых продуктов и лекарств.

Биохимические методы применя­ются и для диагностики гетерозигот­ных состояний у взрослых. Известно, что среди здоровых людей всегда име­ется большое число так называемых носителей патологического гена (ге­терозиготное носительство). Хотя та­кие люди внешне здоровы, вероят­ность появления заболевания у их ре­бенка всегда существует. В связи с этим, выявление гетерозиготного носительства - важная задача медицин­ской генетики.

Понятно, что если в брак вступают гетерозиготные носители какого-либо заболевания, то риск рождения боль­ного ребенка в такой семье составит 25%

Шансы на встречу двух носите­лей одинакового патологического гена выше, если в брак вступают родствен­ники, т.к. они могут унаследовать один и тот же рецессивный ген от своего об­щего предка.

Предположить гетерозиготное но­сительство у женщины можно, если:

Ее отец поражен наследственной болезнью;

У женщины родились больные сы­новья;

Женщина имеет больного брата или братьев;

У двух дочерей женщины роди­лись больные сыновья (или сын);

У здоровых родителей родился больной сын, а у матери в родословной есть больные мужчины.

Выявление гетерозиготных носите­лей того или иного заболевания воз­можно путем использования биохими­ческих тестов (прием фенилаланина для выявления фенилкетонурии, при­ем сахара - сахарного диабета и.т.д.), микроскопического исследования кле­ток крови и тканей, определения активности фермента, измененного в ре­зультата мутации.

Известно, что заболевания, в основе которых лежит нарушение обмена ве­ществ, составляют значительную часть наследственной патологии (фенилкетонурия, галактоземия, алкаптонурия, альбинизм и др.). Так, гетерозиготные носители фенилкетонурии реагируют на введение фенилаланина более силь­ным повышением содержания амино­кислоты в плазме, чем нормальные го­мозиготы (болезнь обусловлена рецес­сивным аллелем).

Биохимический метод широко при­меняется в медико-генетическом кон­сультировании для определения риска рождения больного ребенка. Успехи в области биохимической генетики спо­собствуют более широкому внедре­нию диагностики гетерозиготного носительства в практику. Еще недавно можно было диагностировать не более 10-15 гетерозиготных состояний, в на­стоящее время - более 200. Однако следует отметить, что до сих пор име­ется немало наследственных заболева­ний, для которых методы гетерозигот­ной диагностики еще не разработаны.

56. Пренатальная диагностика хромосомных болезней. Амниоцентез. Медико - генетическое консультирование. Значение для медицины. Пренатальная диагностика хромосомных заболеваний (ПД) - представляет собой комплекс врачебных мероприятий и диагностических методов, направленных на выявление морфологических, структурных, функциональных или молекулярных нарушений внутриутробного развития человека. Методы: 1. Биопсия хорионов - может определить врожденные дефекты плода на очень ранних сроках беременности 9 -11 неделя. Проводится цитогенетическими, молекулярно - генетическими методами. Позволяет выявить синдром Тай-Сакса, серповидно-клеточную анемию, большинство видов муковисцидоза, талассемию и синдром Дауна.

2. Амниоцентез - инвазивная процедура, заключающаяся в пункции амниотической оболочки с целью получения околоплодных вод для последующего лабораторного исследования, амниоредукции или введения в амниотическую полость лекарственных средств. Амниоцентез можно выполнять в первом, втором и третьем триместрах беременности оптимально - в 16-20 недель беременности.

Показания к амниоцентезу: Пренатальная диагностика врождённых и наследственных заболеваний. Лабораторная диагностика врождённых и наследственных заболеваний основана на цитогенетическом и молекулярном анализе амниоцитов. Амниоредукция при многоводии. Интраамниальное введение препаратов для прерывания беременности во втором триместре. Оценка состояния плода во втором и третьем триместрах беременности степень тяжести гемолитической болезни, зрелость сурфактантов лёгких, диагностика внутриутробных инфекций. Фетотерапия. Фетохирургия.

3. Кордоцентез - метод получения кордовой пуповинной крови плода для дальнейшего исследования. Обычно производится параллельно амниоцентезу взятию околоплодных вод. Производится не ранее 18 недель гестации. Через переднюю брюшную стенку беременной после инфильтрационной анестезии под контролем ультразвукового аппарата производят прокол тонкой пункционной иглой, попадают в сосуд пуповины, получают до 5 мл. крови. Метод применим для диагностики хромосомных и наследственных заболеваний, резус - конфликта, гемолитической болезни плода и т.д.

4. УЗИ. Медико-генетическое консультирование - это система оказания специализированной медико-генетической помощи в виде неонатального скрининга на фенилкетонурию и врожденный гипотиреоз; собственно генетического консультирования семей, в которых отмечаются случаи врожденных и наследственных заболеваний ВНЗ; пренатальной диагностики состояния плода в случае следующей беременности, а также пренатального скрининга беременных исследования сывороточных материнских маркеров - альфа-фетопротеина АФП, хорионического гонадотропина ХГ, неэстерифицированного эстриола НЭ и других маркеров.

Механизм развития (патогенез) многих генных заболеваний человека связан с нарушением тех или иных звеньев обмена веществ, сопровождающихся появлением в организме повышенных концентраций определенных метаболитов. В этих случаях в диагностике заболеваний широко используют биохимические методы, позволяющие выявлять продукты нарушенного метаболизма.

Ранняя диагностика таких заболеваний обычно позволяет своевременно начать их патогенетическое лечение (проводить ту или иную коррекцию развивающегося патологического фенотипа). Поэтому уделяется большое внимание разработке «просеивающих» программ, или программ скрининга (от англ, screen - просеивать, сортировать), задачей которых является выявление наследственной патологии при массовом обследовании новорожденных с помощью тех или иных биохимических тестов. Биохимические методы можно применять и при проведении дородовой диагностики заболеваний.

Программа скрининга, как правило, осуществляется в два этапа. На первом этапе (массовый скрининг) проводят исследование больших контингентов детей (в роддомах, детских лечебно-профилактических учреждениях) с использованием относительно простых тестов. На втором этапе (селективный скрининг) уточняют диагноз и характер развития патологии у больных детей, выявленных при массовом обследовании, с помощью более сложных и точных биохимических методов исследования (электрофорез, хроматография, спектрофотометрия, спектроскопия и др.).

Примером успешного использования скринирующей программы могут служить исследования по выявлению детей с фенилкетонурией, проводившиеся в ряде стран. Как известно, в основе этого заболевания лежит блокирование основного биохимического этапа превращения фенилаланина в тирозин. При этом в организме накапливается фенилаланин, и на первое место выступает второстепенный путь его обмена, приводящий к образованию фенилпирувата. Последний не подвергается дальнейшим превращениям, накапливается в крови и тканях ребенка (в основном в форме фенилпировиноградной кислоты), вызывая хроническую интоксикацию организма (прежде всего головного мозга), и выделяется с мочой.

Широкое использование разработанных скрининг-тестов (теста Гатри, пробы с 2,4-динитрофенилгидразином, пробы Феллинга) при массовой диагностике фенилкетонурии позволили, например, в США из 28 млн обследованных новорожденных выявить 2000 больных индивидуумов. В этих случаях удалось избежать развития тяжелых проявлений заболевания путем раннего перевода таких детей на специальную диету с резким ограничением потребления фенилаланина.

Поскольку в крови больных фенилкетонурией повышается концентрация аминокислоты фенилаланина, которая выводится из организма с мочой, в диагностике заболевания практическое применение получил тест Гатри, основанный на использовании мутантных бактерий, неспособных расти на искусственной питательной среде без добавления этой аминокислоты. В указанном тесте стандартные диски фильтровальной бумаги, смоченные каплей крови (либо мочи) исследуемого ребенка, после их высушивания наносят на поверхность плотной диагностической среды в чашке Петри, предварительно засеянной соответствующими бактериями. На основании размеров зоны роста бактерий вокруг диска определяют концентрацию фенилаланина в исследуемом материале. Метод удобен и тем, что фильтровальные диски, смоченные мочой или кровью ребенка, можно пересылать по почте в специализированные лаборатории, в которых проводятся соответствующие биохимические исследования. Для уточнения диагноза в дальнейшем используют методы хроматографии и электрофореза, позволяющие определить аминокислотный состав мочи и сыворотки крови больного.

Ниже приводится краткая информация о некоторых биохимических скрининг-тестах, применяемых при массовой диагностике отдельных наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ. Для исследования используют кровь, мочу, культивирующиеся клетки и другой материал, полученный от того или иного индивидуума.

Проба Феллинга для диагностики фенилкетонурии. К 2 мл свежей мочи добавляют шесть капель 10%-го раствора хлористого железа и уксусной кислоты, вступающих в реакцию с фенилпировиноградной кислотой. Появление сине-зеленой или серо-зеленой окраски свидетельствует о положительном результате пробы, что соответствует уровню фенилаланина в крови порядка 900-1200 мкМоль/л (норма до 120 мкМоль/л или 2 мг%).

Проба с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) на наличие фе- нилпировиноградной кислоты. К 2 мл мочи добавляют такое же количество 0,3%-го раствора 2,4-ДНФГ. Вначале смесь прозрачна. Если в пробе имеется фенилпировиноградная кислота, то в течение 1-3 мин она приобретает ярко-желтый мутный оттенок, который сохраняется в течение суток. Применяется для диагностики фенилкетонурии.

Проба на цистин и гомоцистин. К пяти каплям мочи добавляют каплю концентрированного раствора аммиака и две капли раствора цианида натрия (2 г цианида натрия, 5 мл воды и 95 мл 96%-го этанола). Через несколько минут добавляют несколько капель 5%-го раствора нитропруссида натрия. Реакция считается положительной при появлении темно-красной окраски. Проба используется для диагностики цистинурии (повышенного содержания в моче аминокислоты цистина) и гомоцистинурии (наличия в моче гомоцистина).

Иод-азидная проба на цистин для диагностики цистинурии и гомоцистинурии. Используемый реактив: 1,5 г азида натрия растворяют в 50 мл 0,1%-го раствора йода; полученный раствор разводят в 50 мл 95%-го этанола и хранят в темном сосуде при комнатной температуре. К моче, высушенной на фильтровальной бумаге, добавляют одну каплю реактива и в течение 5 мин наблюдают за выцветанием темно-коричневой окраски. Если выцветание происходит в течение этого времени, то в образце содержится цистин или гомоцистин в повышенных концентрациях.

Тест Миллона (на тирозин). Используемый реактив: 10 г металлической ртути растворяют в 11 мл концентрированной азотной кислоты, полученный раствор медленно вливают в 29 мл дистиллированной воды. На фильтровальную бумагу, смоченную мочой обследуемого индивидуума, наносят одну каплю реактива Миллона. Появление красно-оранжевой окраски свидетельствует о положительной пробе. С помощью этого теста выявляют повышенное содержание тирозина в моче (тирозинурию) при нарушениях метаболизма этой аминокислоты, приводящих к увеличению ее концентрации в плазме крови (тирози- немии).

Проба на галактозу и лактозу. К 1 мл мочи добавляют 0,5 мл концентрированного раствора аммиака и три капли 10%-го раствора NaOH. Пробу нагревают до кипения, при появлении ярко-желтой окраски она считается положительной. Используется при диагностике галактоземии.

Проба Селиванова на фруктозу. Несколько кристаллов резорцина растворяют в 3 мл концентрированной соляной кислоты. К одному объему полученного реактива добавляют два объема мочи, смесь подогревают на водяной бане. При наличии фруктозы наблюдается интенсивное красное окрашивание. Пробу проводят для обнаружения фруктозурии при повышенном содержании этого углевода в крови больного (фруктоземии).

Проба Саржа на фруктозу. На два кристалла КОН наносят две капли мочи, при наличии в ней фруктозы появляется красное окрашивание. Пробу используют для диагностики фруктозурии.

Проба Алъгаузена на глюкозу. К 4 мл мочи добавляют 1 мл 10%-го раствора NaOH, кипятят 1 мин. Через 10 мин сравнивают результат со стандартной шкалой. При положительной пробе - окраска от желтой до интенсивной красно-коричневой. Проводят для выявления глюкозурии.

Проба с цетилтриметиламмония бромидом (ЦТАБ ) на гликозами- ногликаны (мукополисахариды ). Используемый реактив: 2,5%-ный раствор ЦТАБ в 1М цитратном буфере; pH 5,75. К 5 мл мочи добавляют 1 мл реактива. При положительном результате в течение 30 мин наблюдают образование хлопьевидного осадка. Такой результат можно получить при обследовании лиц с синдромами Марфана, Гурлера, Хантера, а также в случае ревматоидного артрита и некоторых других заболеваний.

Тест с толуидиновым синим на мукополисахариды. Используют реактив: 0,04%-ный раствор толуидинового синего в 0,2%-ной уксусной кислоте. Одну каплю мочи наносят на фильтровальную бумагу, высушивают при комнатной температуре, погружают в реактив на 1 мин, после чего отмывают в 95%-ном этаноле. Толуидиновый синий реагирует с кислыми гликозаминогликанами как катионовый краситель, давая стойкое пурпурное кольцо на голубом фоне.

Проба на порфирию. Пробу проводят с мочой или фекалиями, к которым добавляют реактив, содержащий амиловый спирт, ледяную уксусную кислоту и эфир в равных количествах. Появление бриллиантово-розовой флюоресценции при освещении ультрафиолетом свидетельствует о наличии порфирина.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

• 1. Укажите, при каких из приведенных заболеваний возможно проведение массового скрининга с использованием биохимических тестов:
  • а) фенилкетонурия;
  • б) болезнь Дауна;
  • в) трисомия X;
  • г) галактоземия;
  • д) тирозинемия.
• 2. Перечислите методы диагностики, применяемые при подозрении на следующие заболевания: галактоземию, фенилкетонурию, болезнь Дауна, фруктоземию.