Reazione di precipitazione in fase liquida. Reazione di precipitazione (metodo immunologico). Immunodiffusione di Ouchterlony
La particolarità di questa reazione è che l'interazione dell'antigene con l'anticorpo avviene in un mezzo semisolido: vengono utilizzati gel, spesso agar, a volte gel di amido, poliacrilammide, ecc.
La reazione di precipitazione del gel viene eseguita in piastre Petri o su vetrini. Gli ingredienti della reazione - antigene e anticorpi - vengono posti in pozzetti (pozzetti) ritagliati nell'agar.
Esistono due metodi per la precipitazione per diffusione nell'agar: il metodo di immunodiffusione semplice (o radiale), quando una delle sostanze reagenti dal pozzetto diffonde nell'agar contenente una concentrazione costante dell'altro componente reagente, e il metodo di immunodiffusione doppia, quando entrambi i componenti l'antigene e l'anticorpo vengono posti nei pozzetti, diffusi l'uno verso l'altro nello strato di gel di agar. Nel punto di incontro dell'antigene e dell'anticorpo si formano zone di precipitazione (un anello di precipitato con immunodiffusione semplice e una linea di precipitato con doppia immunodiffusione). A seconda della complessità del sistema antigene-anticorpo possono comparire una o più linee di precipitazione. Per stabilire il titolo del siero precipitante si effettuano reazioni di precipitazione con varie diluizioni dell'antigene. La diluizione massima dell'antigene che dà la precipitazione con il siero è il titolo di questo siero precipitante.
Un esempio di reazione di precipitazione in un gel è la reazione tra la tossina difterica e il siero antidifterite, chiamata reazione di doppia immunodiffusione di Ouchterlony.
Colture tossigeniche di bacilli difterici inoculati con placche.
Colture non tossigeniche seminate con placche.
Carta da filtro impregnata di siero antidifterite.
Linee dal precipitato.
Gel di agar.
L'immunoelettroforesi combina il metodo dell'elettroforesi e delle reazioni di precipitazione. La miscela di antigeni viene separata nel gel mediante elettroforesi, quindi nella scanalatura parallela alle zone di elettroforesi viene introdotto il siero immunitario, i cui anticorpi si diffondono nel gel e formano linee dal precipitato nel punto di contatto con l'antigene.
Con il suo aiuto, vengono analizzate con successo le proteine nel siero del sangue, nel liquido cerebrospinale, nelle urine, nel latte, negli estratti di organi, nonché nelle proteine di origine vegetale e batterica.
Reazioni di lisi.
Per fare questo devi sapere:
La lisi immunitaria è la dissoluzione delle cellule sotto l'influenza obbligatoria degli anticorpi del complemento.
Per la reazione di cui hai bisogno:
1. Antigene: microbi, globuli rossi o altre cellule.
2. Anticorpo: siero immunitario, meno spesso siero del paziente.
Il siero immune si ottiene iperimmunizzando un coniglio con il corrispondente antigene corpuscolare (cellule microbiche, globuli rossi, ecc.). Ad esempio, nella reazione di emolisi e nella reazione di fissazione del complemento (vedi sotto), viene utilizzato il siero emolitico, ottenuto iperimmunizzando un coniglio con globuli rossi di pecora; Il siero di sangue di coniglio così ottenuto contiene anticorpi (emolisine) contro i globuli rossi di pecora. In questo modo si ottengono anche sieri batteriolitici contenenti anticorpi coinvolti nella lisi dei batteri.
3. Il complemento è un complesso complesso termolabile di proteine del siero del sangue che, una volta attivate, reagiscono tra loro in una certa sequenza e formano un complesso litico di attacco di membrana. Nel siero, il complemento è in uno stato inattivo e viene attivato al momento della formazione del complesso antigene-anticorpo (adsorbito sul complesso antigene-anticorpo). C'è molto complemento nel siero fresco di cavia.
Tra le reazioni di lisi, la reazione più comunemente utilizzata è l'emolisi e meno frequentemente la batteriolisi (principalmente per la differenziazione del colera e dei vibrioni colera-simili).
Messa in scena della reazione di emolisi.
Per mettere in scena una reazione di emolisi è necessario:
Sospensione di eritrociti di pecora al 3% in soluzione isotonica;
Siero emolitico standard, preparato nelle condizioni di produzione e diluito con una soluzione isotonica 2 - 3 volte inferiore al suo titolo (il titolo del siero emolitico è la diluizione più alta alla quale avviene l'emolisi completa del 3% di una sospensione di eritrociti di pecora in presenza di complemento);
Complemento diluito con soluzione isotonica 1:10.
Se gli eritrociti di pecora (antigene), il siero emolitico (anticorpo) e il complemento vengono posti in una provetta in determinati rapporti quantitativi, entro pochi minuti la miscela cambierà: da rosso scuro diventerà rosa (laccato) a causa della distruzione degli eritrociti e il rilascio di emoglobina.
La reazione di emolisi ha una specificità strettamente definita. Viene utilizzato come indicatore per impostare la reazione di fissazione del complemento.
Sotto forma di nuvolosità chiamata precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario. La reazione di precipitazione viene effettuata in provette (reazione di precipitazione ad anello), in gel, mezzi nutritivi, ecc. Varietà della reazione di precipitazione in agar semiliquido o gel di agarosio sono molto diffuse: doppia immunodiffusione secondo Ouchterlony, immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi , eccetera.
Reazione di precipitazione dell'anello. La reazione viene effettuata in strette provette di precipitazione: un antigene solubile viene stratificato sul siero immunitario. Con un rapporto ottimale tra antigene e anticorpi, al confine di queste due soluzioni si forma un anello opaco di precipitato (Fig. 7.50). Se come antigeni nella reazione vengono utilizzati estratti di tessuto bolliti e filtrati, questa reazione viene chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli, in cui viene rilevato l'aptene dell'antrace).
Riso. 7,50.
Doppia reazione di immunodiffusione di Ouchterlony.
Per impostare la reazione, uno strato sottile di gel di agar fuso viene versato su una lastra di vetro e dopo l'indurimento vengono ritagliati dei pozzetti. Gli antigeni e i sieri immunitari vengono inseriti separatamente nei pozzetti del gel, che si diffondono l'uno verso l'altro. Nel punto d'incontro, in proporzioni equivalenti, formano un precipitato a forma di striscia bianca (Fig. 7.51). Nei sistemi multicomponente compaiono diverse linee di precipitato tra i pozzetti con antigeni e anticorpi; Per antigeni identici, le linee del precipitato si uniscono e per antigeni non identici si intersecano.
Riso. 7.51
Il siero immune con gel di agar fuso viene versato uniformemente sul vetro. Dopo l'indurimento nel gel vengono realizzati dei pozzetti nei quali viene posto l'antigene (Ag) in varie diluizioni. L'antigene, diffondendosi nel gel, forma zone di precipitazione ad anello attorno ai pozzetti con anticorpi. Il diametro dell'anello di precipitazione è proporzionale alla concentrazione dell'antigene (Fig. 7.52). La reazione viene utilizzata per determinare le immunoglobuline di varie classi, componenti del sistema del complemento, ecc. nel siero del sangue.
Riso. 7.52.
Una combinazione di elettroforesi e immunoprecipitazione: una miscela di antigeni viene introdotta nei pozzetti del gel e separata nel gel mediante elettroforesi, quindi il siero immune viene aggiunto nella scanalatura del gel parallelamente alle zone di elettroforesi. Gli anticorpi del siero immunitario si diffondono nel gel e formano linee di precipitazione nel punto di “incontro” con l'antigene (Fig. 7.53).
Riso. 7.53.
Reazione di flocculazione (secondo Ramon) (dal lat. flocco- scaglie di lana) - la comparsa di opalescenza o massa flocculante (immunoprecipitazione) in una provetta durante la reazione tossina-antitossina o tossoide-antitossina (Fig. 7.54). Viene utilizzato per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide.
Riso. 7.54.
I ceppi dell'agente eziologico della difterite - C. diphtheriae possono essere tossigeni (producendo esotossina) e non tossigeni. La formazione di un'esotossina dipende dalla presenza nei batteri di un profago portatore di un gene tox che codifica per la formazione di un'esotossina. In caso di malattia, tutti gli isolati vengono testati per la tossigenicità - la produzione di esotossina difterica utilizzando la reazione di precipitazione dell'agar (Fig. 7.55).
Riso. 7.55
Le reazioni degli antigeni con gli anticorpi sono chiamate sierologiche o umorali perché gli anticorpi specifici coinvolti sono sempre presenti nel siero del sangue.
Le reazioni tra anticorpi e antigeni che si verificano in un organismo vivente possono essere riprodotte in laboratorio per scopi diagnostici.
Le reazioni immunitarie sierologiche sono entrate nella pratica diagnostica delle malattie infettive alla fine del XIX e all'inizio del XX secolo.
L'uso delle reazioni immunitarie per scopi diagnostici si basa sulla specificità dell'interazione dell'antigene con l'anticorpo.
La determinazione della struttura antigenica dei microbi e delle loro tossine ha permesso di sviluppare non solo sieri diagnostici e terapeutici, ma anche sieri diagnostici. I sieri diagnostici immunitari si ottengono immunizzando animali (ad esempio conigli). Questi sieri vengono utilizzati per identificare microbi o esotossine mediante struttura antigenica mediante reazioni sierologiche (agglutinazione, precipitazione, fissazione del complemento, emoagglutinazione passiva, ecc.). I sieri immunodiagnostici trattati con fluorocromo vengono utilizzati per la diagnosi rapida di malattie infettive utilizzando il metodo di immunofluorescenza.
Utilizzando antigeni noti (diagnosticum), è possibile determinare la presenza di anticorpi nel siero del sangue di un paziente o soggetto (diagnosi sierologica delle malattie infettive).
La presenza di sieri immunitari specifici (diagnostici) consente di stabilire la specie e il tipo di microrganismo (identificazione sierologica del microbo mediante struttura antigenica).
La manifestazione esterna dei risultati delle reazioni sierologiche dipende dalle condizioni della sua produzione e dallo stato fisiologico dell'antigene.
Gli antigeni corpuscolari danno il fenomeno dell'agglutinazione, della lisi, della fissazione del complemento, dell'immobilizzazione.
Gli antigeni solubili danno luogo al fenomeno della precipitazione e della neutralizzazione.
Nella pratica di laboratorio, le reazioni di agglutinazione, precipitazione, neutralizzazione, fissazione del complemento, inibizione dell'emoagglutinazione, ecc. vengono utilizzate per scopi diagnostici.
Reazione di agglutinazione (RA)
Per la sua specificità, facilità di esecuzione e dimostrabilità, la reazione di agglutinazione si è diffusa nella pratica microbiologica per la diagnosi di molte malattie infettive: febbre tifoide e paratifo (reazione di Vidal), tifo (reazione di Weigl), ecc.
La reazione di agglutinazione si basa sulla specificità dell'interazione degli anticorpi (agglutinine) con intere cellule microbiche o di altro tipo (agglutinogeni). Come risultato di questa interazione, si formano particelle: agglomerati che precipitano (agglutinano).
La reazione di agglutinazione può coinvolgere sia batteri vivi che uccisi, spirochete, funghi, protozoi, rickettsie, nonché globuli rossi e altre cellule.
La reazione avviene in due fasi: la prima (invisibile) è specifica, l'associazione di antigene e anticorpi, la seconda (visibile) è aspecifica, l'incollaggio degli antigeni, cioè formazione di agglutinati.
Un agglutinato si forma quando un centro attivo di un anticorpo bivalente si combina con il gruppo determinante di un antigene.
La reazione di agglutinazione, come ogni reazione sierologica, avviene in presenza di elettroliti.
Esternamente, la manifestazione di una reazione di agglutinazione positiva ha un duplice carattere. Nei microbi flagellati che hanno solo l'antigene O somatico, le cellule microbiche stesse aderiscono direttamente. Questa agglutinazione è detta a grana fine. Si verifica entro 18 – 22 ore.
I microbi flagellari hanno due antigeni: l'antigene O somatico e l'antigene H flagellare. Se le cellule vengono incollate insieme dai flagelli, si formano scaglie grandi e sciolte e questa reazione di agglutinazione viene chiamata a grana grossa. Si verifica entro 2 – 4 ore.
La reazione di agglutinazione può essere eseguita sia allo scopo di determinare qualitativamente e quantitativamente anticorpi specifici nel siero del paziente, sia allo scopo di determinare la specie dell'agente patogeno isolato.
La reazione di agglutinazione può essere eseguita sia in una versione espansa, che consente di lavorare con siero diluito a un titolo diagnostico, sia nella versione di reazione indicativa, che consente, in linea di principio, di rilevare anticorpi specifici o determinare la specie del agente patogeno.
Quando si esegue una reazione di agglutinazione dettagliata, per rilevare anticorpi specifici nel siero del soggetto, il siero da testare viene prelevato ad una diluizione di 1:50 o 1:100. Ciò è dovuto al fatto che gli anticorpi normali possono essere presenti in concentrazioni molto elevate nel siero intero o leggermente diluito e quindi i risultati della reazione potrebbero essere imprecisi. Il materiale testato in questa versione della reazione è il sangue del paziente. Il sangue viene prelevato a stomaco vuoto o non prima di 6 ore dopo un pasto (altrimenti potrebbero esserci goccioline di grasso nel siero del sangue, rendendolo torbido e inadatto alla ricerca). Il siero sanguigno del paziente viene solitamente ottenuto nella seconda settimana di malattia, raccogliendo sterilmente 3-4 ml di sangue dalla vena cubitale (a questo punto è concentrata la quantità massima di anticorpi specifici). Come antigene noto viene utilizzato un diagnosticum preparato da cellule microbiche uccise ma non distrutte di una specie specifica con una struttura antigenica specifica.
Quando si esegue una reazione di agglutinazione dettagliata per determinare la specie e il tipo di agente patogeno, l'antigene è un agente patogeno vivo isolato dal materiale studiato. Sono noti gli anticorpi contenuti nel siero diagnostico immunitario.
Il siero diagnostico immunitario è ottenuto dal sangue di un coniglio vaccinato. Dopo aver determinato il titolo (la diluizione massima alla quale vengono rilevati gli anticorpi), il siero diagnostico viene versato in fiale con l'aggiunta di un conservante. Questo siero viene utilizzato per l'identificazione mediante la struttura antigenica del patogeno isolato.
Quando si esegue una reazione di agglutinazione indicativa su un vetrino, vengono utilizzati sieri con una concentrazione di anticorpi più elevata (in diluizioni non superiori a 1:10 o 1:20).
Usando una pipetta Pasteur, viene applicata sul vetro una goccia di soluzione salina e siero. Quindi una piccola quantità di microbi viene aggiunta a ciascuna goccia in un ciclo e miscelata accuratamente fino ad ottenere una sospensione omogenea. Dopo alcuni minuti, in caso di reazione positiva, nella goccia di siero appare un notevole affollamento di microbi (granularità), mentre nella goccia di controllo rimane una torbidità uniforme.
La reazione di agglutinazione approssimativa viene spesso utilizzata per determinare le specie di microbi isolati dal materiale di prova. Il risultato ottenuto ci consente di accelerare approssimativamente la diagnosi della malattia. Se la reazione è difficile da vedere ad occhio nudo, può essere osservata al microscopio. In questo caso si parla di microagglutinazione.
La reazione di agglutinazione approssimativa, che viene eseguita con una goccia di sangue del paziente e un antigene noto, è chiamata goccia di sangue.
Reazione di emoagglutinazione indiretta o passiva (IPHA)
Questa reazione è superiore in sensibilità alla reazione di agglutinazione e viene utilizzata nella diagnosi di infezioni causate da batteri, rickettsie, protozoi e altri microrganismi.
L'RPGA consente di rilevare una piccola concentrazione di anticorpi.
Questa reazione coinvolge eritrociti di pecora abbronzati o eritrociti umani con sangue del gruppo I, sensibilizzati con antigeni o anticorpi.
Se nel siero del test vengono rilevati anticorpi, vengono utilizzati globuli rossi sensibilizzati con antigeni (eritrociti diagnostici).
In alcuni casi, se è necessario determinare vari antigeni nel materiale di prova, vengono utilizzati eritrociti sensibilizzati con immunoglobuline.
I risultati dell'RPGA vengono presi in considerazione in base alla natura del sedimento eritrocitario.
Il risultato di una reazione è considerato positivo quando i globuli rossi ricoprono uniformemente l'intero fondo della provetta (un ombrello rovesciato).
In una reazione negativa, i globuli rossi sotto forma di un piccolo disco (pulsante) si trovano al centro del fondo della provetta.
Reazione di precipitazione (RP)
A differenza della reazione di agglutinazione, l'antigene per la reazione di precipitazione (precipitinogeno) sono composti solubili, la cui dimensione delle particelle si avvicina alla dimensione delle molecole.
Questi possono essere proteine, complessi di proteine con lipidi e carboidrati, estratti microbici, vari lisati o filtrati di colture microbiche.
Gli anticorpi che causano la proprietà precipitante del siero immunitario sono chiamati precipitine e il prodotto della reazione sotto forma di precipitato è chiamato precipitato.
I sieri precipitanti si ottengono immunizzando artificialmente un animale con microbi vivi o uccisi, nonché una varietà di lisati ed estratti di cellule microbiche.
Mediante l'immunizzazione artificiale è possibile ottenere sieri precipitanti verso qualsiasi proteina estranea di origine vegetale e animale, nonché verso gli apteni, quando un animale viene immunizzato con un antigene a tutti gli effetti contenente questo aptene.
Il meccanismo della reazione di precipitazione è simile al meccanismo della reazione di agglutinazione. L'effetto della precipitazione dei sieri sull'antigene è simile all'effetto dei sieri agglutinanti. In entrambi i casi, sotto l'influenza del siero immunitario e degli elettroliti, le particelle antigeniche sospese nel liquido diventano più grandi (diminuzione del grado di dispersione). Tuttavia, per la reazione di agglutinazione, l'antigene viene assunto sotto forma di una sospensione microbica torbida omogenea (sospensione) e per la reazione di precipitazione - sotto forma di una soluzione colloidale trasparente.
La reazione di precipitazione è altamente sensibile e consente la rilevazione di quantità trascurabili di antigene.
La reazione di precipitazione viene utilizzata nella pratica di laboratorio per la diagnosi di peste, tularemia, antrace, meningite e altre malattie, nonché negli esami medici forensi.
Nella pratica sanitaria, questa reazione viene utilizzata per determinare la falsificazione dei prodotti alimentari.
La reazione di precipitazione può essere effettuata non solo in provette, ma anche in un gel e per gli studi immunologici fini dell'antigene viene utilizzato il metodo dell'immunoforesi.
La reazione di precipitazione del gel di agar, o metodo di precipitazione diffusa, consente uno studio dettagliato della composizione di miscele antigeniche complesse idrosolubili. Per effettuare la reazione si utilizza un gel (agar semiliquido o più denso). Ciascun componente che costituisce l'antigene diffonde verso l'anticorpo corrispondente a velocità diverse. Pertanto, i complessi di vari antigeni e anticorpi corrispondenti si trovano in diverse aree del gel, dove formano linee di precipitazione. Ogni linea corrisponde ad un solo complesso antigene-anticorpo. La reazione di precipitazione viene solitamente condotta a temperatura ambiente.
Il metodo dell'immunoforesi si è diffuso nello studio della struttura antigenica delle cellule microbiche.
Il complesso antigene viene posto in un pozzetto situato al centro di un campo di agar versato sulla piastra. Una corrente elettrica viene fatta passare attraverso il gel di agar. I vari antigeni compresi nel complesso si muovono per effetto dell'azione della corrente, in funzione della loro mobilità elettroforetica. Una volta completata l'elettroforesi, il siero immunitario specifico viene aggiunto ad una fossa situata lungo il bordo della piastra e posto in una camera umida. Le linee di precipitazione compaiono nei siti in cui si forma il complesso antigene-anticorpo.
Reazione di neutralizzazione dell'esotossina con antitossina (RN)
La reazione si basa sulla capacità del siero antitossico di neutralizzare l'effetto dell'esotossina. Viene utilizzato per la titolazione di sieri antitossici e la determinazione dell'esotossina.
Quando si titola il siero, una certa dose della tossina corrispondente viene aggiunta a diverse diluizioni del siero antitossico. Quando l'antigene è completamente neutralizzato e non sono presenti anticorpi non spesi, si verifica la flocculazione iniziale.
La reazione di flocculazione può essere utilizzata non solo per la titolazione del siero (ad esempio della difterite), ma anche per la titolazione della tossina e del tossoide.
La reazione di neutralizzazione delle tossine con antitossina è di grande importanza pratica come metodo per determinare l'attività dei sieri terapeutici antitossici. L'antigene in questa reazione è una vera esotossina.
La concentrazione del siero antitossico è determinata dalle unità convenzionali di AE.
1 AE di siero antitossico difterico è la quantità che neutralizza 100 DLM di esotossina difterica. 1 AE di siero botulinico è la quantità che neutralizza 1000 DLM di tossina botulinica.
La reazione di neutralizzazione per determinare la specie o il tipo di esotossina (per la diagnosi di tetano, botulismo, difterite, ecc.) Può essere effettuata in vitro (secondo Ramon) e quando si determina la tossigenicità delle cellule microbiche - in un gel ( secondo Ouchterlony).
Reazione di lisi (RL)
Una delle proprietà protettive del siero immunitario è la sua capacità di dissolvere i microbi o gli elementi cellulari che entrano nel corpo.
Gli anticorpi specifici che causano la dissoluzione cellulare (lisi) sono chiamati lisine. A seconda della natura dell'antigene, possono essere batteriolisine, citolisine, spirochetolisine, emolisine, ecc.
Le lisine manifestano il loro effetto solo in presenza di un fattore aggiuntivo: il complemento.
Il complemento, come fattore di immunità umorale aspecifica, si trova in quasi tutti i fluidi corporei, ad eccezione del liquido cerebrospinale e del liquido della camera anteriore dell'occhio. Nel siero del sangue umano si nota un contenuto abbastanza elevato e costante di complemento, mentre in grande quantità nel siero di cavie. In altri mammiferi, il contenuto del complemento nel siero sanguigno è diverso.
Il complemento è un sistema complesso di proteine del siero di latte. È instabile e collassa a 55 gradi per 30 minuti. A temperatura ambiente il complemento viene distrutto entro due ore. Molto sensibile agli scuotimenti prolungati, agli acidi e ai raggi ultravioletti. Tuttavia, il complemento viene conservato a lungo (fino a sei mesi) allo stato essiccato a basse temperature.
Il complemento promuove la lisi delle cellule microbiche e dei globuli rossi.
Viene fatta una distinzione tra le reazioni di batteriolisi ed emolisi.
L'essenza della reazione di batteriolisi è che quando uno specifico siero immunitario si combina con le sue corrispondenti cellule microbiche viventi omologhe in presenza di complemento, avviene la lisi microbica.
La reazione di emolisi è che quando gli eritrociti vengono esposti ad un siero specifico che ne è immune (emolitico) in presenza di complemento, si osserva la dissoluzione degli eritrociti, cioè emolisi.
La reazione di emolisi nella pratica di laboratorio viene utilizzata per determinare l'intervallo del complemento, nonché per tenere conto dei risultati delle reazioni di fissazione diagnostica del complemento di Bordet-Giangu e Wassermann.
Il titolo del complemento è la sua quantità più piccola, che provoca la lisi dei globuli rossi entro 30 minuti in un sistema emolitico in un volume di 2,5 ml. La reazione di lisi, come tutte le reazioni sierologiche, avviene in presenza di un elettrolita.
Reazione di fissazione del complemento (CFR)
Questa reazione viene utilizzata negli studi di laboratorio per rilevare anticorpi nel siero sanguigno per varie infezioni, nonché per identificare l'agente patogeno in base alla sua struttura antigenica.
La reazione di fissazione del complemento è una reazione sierologica complessa ed è altamente sensibile e specifica.
Una caratteristica di questa reazione è che il cambiamento nell'antigene durante la sua interazione con anticorpi specifici avviene solo in presenza del complemento. Il complemento viene adsorbito solo sul complesso anticorpo-antigene. Il complesso anticorpo-antigene si forma solo se esiste affinità tra l'antigene e l'anticorpo nel siero.
L'adsorbimento del complemento sul complesso antigene-anticorpo può avere effetti diversi sul destino dell'antigene a seconda delle sue caratteristiche.
Alcuni antigeni subiscono in queste condizioni bruschi cambiamenti morfologici, fino alla dissoluzione (emolisi, fenomeno di Isaev-Pfeiffer, effetto citolitico). Altri modificano la velocità del movimento (immobilizzazione del treponema). Altri ancora muoiono senza improvvisi cambiamenti distruttivi (effetto battericida o citotossico). Infine, l'adsorbimento del complemento può non essere accompagnato da cambiamenti dell'antigene facilmente osservabili (reazioni di Bordet-Zhangou, Wasserman).
Secondo il meccanismo RSC, avviene in due fasi:
a) La prima fase è la formazione del complesso antigene-anticorpo e l'adsorbimento del complemento su questo complesso. Il risultato della fase non è visivamente visibile.
b) La seconda fase è un cambiamento nell'antigene sotto l'influenza di anticorpi specifici in presenza di complemento. Il risultato della fase può essere visibile visivamente oppure no.
Nel caso in cui i cambiamenti nell'antigene rimangano inaccessibili all'osservazione visiva, è necessario utilizzare un secondo sistema, che funge da indicatore, consentendo di valutare lo stato del complemento e trarre una conclusione sul risultato della reazione.
Questo sistema di indicatori è rappresentato dai componenti della reazione di emolisi, che comprende eritrociti di pecora e siero emolitico, che contiene anticorpi specifici contro gli eritrociti (emolisine), ma non contiene complemento. Questo sistema indicatore viene aggiunto alle provette un'ora dopo il posizionamento dell'RSC principale.
Se la reazione di fissazione del complemento è positiva, si forma un complesso anticorpo-antigene che adsorbe il complemento su se stesso. Poiché il complemento viene utilizzato nella quantità necessaria per una sola reazione e la lisi degli eritrociti può avvenire solo in presenza di complemento, quando viene adsorbito sul complesso antigene-anticorpo, la lisi degli eritrociti nel sistema emolitico (indicatore) non avviene verificarsi. Se la reazione di fissazione del complemento è negativa, il complesso antigene-anticorpo non si forma, il complemento rimane libero e quando viene aggiunto un sistema emolitico avviene la lisi degli eritrociti.
Reazione di emoagglutinazione (HRA)
Nella pratica di laboratorio vengono utilizzate due reazioni di emoagglutinazione che differiscono nel loro meccanismo d'azione.
In un caso, la reazione di emoagglutinazione è classificata come sierologica. In questa reazione, i globuli rossi vengono agglutinati quando interagiscono con anticorpi appropriati (emoagglutinine). La reazione è ampiamente utilizzata per determinare il gruppo sanguigno.
In un altro caso, la reazione di emoagglutinazione non è sierologica.
In esso, l'incollaggio dei globuli rossi non è causato da anticorpi, ma da sostanze speciali (emoagglutinine) formate da virus. Ad esempio, il virus dell’influenza agglutina i globuli rossi dei polli e il virus della poliomielite agglutina i globuli rossi delle scimmie. Questa reazione consente di giudicare la presenza di un particolare virus nel materiale in esame.
I risultati della reazione vengono presi in considerazione dalla posizione dei globuli rossi. Se il risultato è positivo, i globuli rossi sono disposti in modo lasco, rivestendo il fondo della provetta a forma di “ombrello rovesciato”. Se il risultato è negativo, i globuli rossi si depositano sul fondo della provetta in un sedimento compatto (“bottone”).
Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI)
Si tratta di una reazione sierologica in cui specifici anticorpi antivirali, interagendo con il virus (antigene), lo neutralizzano e lo privano della capacità di agglutinare i globuli rossi, cioè di agglutinare i globuli rossi. inibire la reazione di emoagglutinazione.
L'elevata specificità della reazione di inibizione dell'agglutinazione ne consente l'utilizzo per determinare il tipo e il tipo di virus o per identificare anticorpi specifici nel siero del test.
Reazione di immunofluorescenza (RIF)
La reazione si basa sul fatto che i sieri immunitari, ai quali sono attaccati chimicamente i fluorocromi, quando interagiscono con i corrispondenti antigeni, formano uno specifico complesso luminoso, visibile al microscopio a fluorescenza. I sieri trattati con fluorocromi sono detti luminescenti.
Il metodo è altamente sensibile, semplice e non richiede l'isolamento di una coltura pura, perché i microrganismi vengono rilevati direttamente nel materiale di prova. Il risultato può essere ottenuto 30 minuti dopo aver applicato il siero luminescente sul preparato.
La reazione di immunofluorescenza viene utilizzata per la diagnosi rapida di molte infezioni.
Nella pratica di laboratorio vengono utilizzati due tipi di reazione di immunofluorescenza: diretta e indiretta.
Il metodo diretto prevede che l'antigene venga immediatamente trattato con siero immunofluorescente.
Il metodo indiretto di immunofluorescenza consiste nel fatto che il farmaco viene inizialmente trattato con siero diagnostico immunitario ordinario (non fluorescente) specifico per l'antigene desiderato. Se il preparato contiene un antigene specifico per un dato siero diagnostico, si forma un complesso “antigene-anticorpo”, che non può essere visto. Se questa preparazione viene ulteriormente trattata con siero luminescente contenente anticorpi specifici contro le globuline sieriche del complesso “antigene-anticorpo”, si verificherà l'adsorbimento degli anticorpi luminescenti sulle globuline del siero diagnostico e, di conseguenza, i contorni luminescenti delle cellule microbiche la cellula può essere vista al microscopio luminescente.
Reazione di immobilizzazione (RI)
La capacità del siero immune di provocare l'immobilizzazione dei microrganismi mobili è associata ad anticorpi specifici che manifestano il loro effetto in presenza del complemento. Anticorpi immobilizzanti sono stati trovati nella sifilide, nel colera e in alcune altre malattie infettive.
Ciò è servito come base per lo sviluppo del test di immobilizzazione del treponema, che nella sua sensibilità e specificità è superiore ad altri test sierologici utilizzati nella diagnosi di laboratorio della sifilide.
Reazione di neutralizzazione del virus (VRN)
Gli anticorpi che possono neutralizzare le proprietà infettive del virus si trovano nel siero del sangue di persone che sono state immunizzate o che hanno avuto una malattia virale. Questi anticorpi vengono rilevati mescolando il siero con il virus corrispondente e quindi introducendo questa miscela nel corpo di animali da laboratorio sensibili o infettando una coltura cellulare. Sulla base della sopravvivenza degli animali o dell'assenza dell'effetto citopatico del virus, viene giudicata la capacità neutralizzante degli anticorpi.
Questa reazione è ampiamente utilizzata in virologia per determinare il tipo o il tipo di virus e il titolo degli anticorpi neutralizzanti.
I metodi moderni per diagnosticare le malattie infettive includono il metodo di immunofluorescenza per il rilevamento di antigeni e anticorpi, il metodo di dosaggio immunoenzimatico radioimmunoenzimatico, il metodo di immunoblotting, il rilevamento di antigeni e anticorpi mediante anticorpi monoclonali, il metodo di rilevamento di antigeni mediante reazione a catena della polimerasi (PCR - diagnostica), ecc.
La reazione di precipitazione (RP) è la formazione e precipitazione di un complesso di antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di una nuvola chiamata precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario.
A differenza della reazione di agglutinazione, l'antigene per la reazione di precipitazione sono composti solubili, la cui dimensione delle particelle si avvicina alla dimensione delle molecole. Questi possono essere proteine, complessi di proteine con carboidrati e lipidi, estratti batterici, vari disati o filtrati di colture di brodo di microbi. Gli anticorpi coinvolti nella reazione di precipitazione sono chiamati precipitine. Il risultante complesso antigene-anticorpo finemente disperso viene rilevato utilizzando determinati metodi di stadiazione della reazione di precipitazione.
La reazione di precipitazione dell'anello fu proposta per la prima volta da Ascoli. Viene utilizzato nella diagnosi dell'antrace, della peste, della tularemia e della meningite. Il metodo è semplice e accessibile.
Il siero immunoprecipitante specifico viene versato in strette provette di precipitazione e l'antigene viene stratificato con molta attenzione su di esso. Ad esempio, quando si diagnostica l'antrace, come antigene vengono presi pezzi di pelle, lana, pelle di un animale morto, ecc., Vengono bolliti, il liquido viene filtrato e utilizzato come antigene. La comparsa di un anello - precipitato - al confine di due liquidi indica la presenza dell'antigene corrispondente.
La reazione di precipitazione del gel di agar, o il metodo di precipitazione per diffusione, consente di studiare in dettaglio la composizione di miscele antigeniche complesse idrosolubili. Per impostare la reazione, utilizzare un gel (agar semiliquido o più denso). Ciascun componente che costituisce l'antigene diffonde verso l'anticorpo corrispondente a velocità diverse. Pertanto, i complessi di vari antigeni e anticorpi corrispondenti si trovano in diverse parti del gel, dove si formano le linee di precipitazione. Ogni linea corrisponde ad un solo complesso antigene-anticorpo. La reazione di precipitazione viene solitamente condotta a temperatura ambiente.
Il metodo dell'immunoelettroforesi si è diffuso negli ultimi anni nello studio della struttura antigenica dei microbi. Il complesso antigene viene posto in un pozzetto, che si trova al centro del gel di agar versato sulla piastra. Una corrente elettrica viene quindi fatta passare attraverso il gel di agar, facendo muovere i vari antigeni inclusi nel complesso attraverso il campo di corrente elettrica a seconda della loro mobilità elettroforetica. Una volta completata l'elettroforesi, il siero immunitario specifico viene aggiunto ad una fossa situata lungo il bordo della piastra e posto in una camera umida. Le linee di precipitazione compaiono nei siti in cui si forma il complesso antigene-anticorpo.
La reazione di precipitazione è un metodo molto sensibile e viene utilizzata nello studio di vari antigeni proteici e polisaccaridici nella pratica forense per determinare il tipo di macchie di sangue, sperma, siero presenti su biancheria e oggetti vari. Questa reazione può essere utilizzata anche per identificare varie impurità nel latte, nel pesce e nei prodotti a base di carne e per determinare la natura delle proteine contenute nei colori degli antichi maestri della pittura.
L'RP viene posto in provette (reazione di precipitazione ad anello), in gel, terreni nutritivi, ecc. Sono molto diffuse le varietà di RP in agar semiliquido o gel di agarosio: doppia immunodiffusione secondo Ouchterlony, immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi, ecc.
Meccanismo
Si effettua con antigeni colloidali solubili trasparenti estratti da materiale patologico, oggetti ambientali o colture batteriche pure. La reazione utilizza sieri precipitanti diagnostici trasparenti con titoli anticorpali elevati. Per titolo del siero precipitante si intende la diluizione più alta dell'antigene che, interagendo con il siero immunitario, provoca la formazione di un precipitato visibile - torbidità.
La reazione di precipitazione ad anello viene effettuata in provette strette (diametro 0,5 cm), in cui vengono aggiunti 0,2-0,3 ml di siero precipitante. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur, si stratificano lentamente 0,1-0,2 ml di soluzione antigenica. I tubi vengono trasferiti con cura in una posizione verticale. La reazione viene presa in considerazione dopo 1-2 minuti. In caso di reazione positiva, al confine tra il siero e l'antigene del test appare un precipitato sotto forma di un anello bianco. Nelle provette di controllo non si forma alcun precipitato.
Questo articolo si concentrerà sul fenomeno della reazione di precipitazione. Qui esamineremo le caratteristiche di questo fenomeno, il fenomeno della diffusione, le caratteristiche generali, il ruolo nella vita umana e molto altro.
Introduzione al fenomeno
La precipitazione è un fenomeno di tipo sierologico, durante il quale gli antigeni solubili interagiscono con gli anticorpi e, di conseguenza, si forma un precipitato.
La caratteristica generale della reazione di precipitazione è una forma di influenza concertata di antigene e anticorpo. Questi tipi di interazioni consentono di determinare la presenza di antigeni sconosciuti nella sostanza in esame aggiungendo anticorpi e antigeni noti. Il processo di precipitazione senza la presenza di sali procederà peggio e il miglior ottimale si trova nell'intervallo 7,0-7,4 pH.
Componenti di una reazione
Tra i componenti della reazione di precipitazione si distinguono tre elementi principali:
- Un antigene di natura molecolare. È in uno stato finemente suddiviso, in altre parole è solubile. E anche un tale antigene è chiamato precipitogeno, che è un lisato o un estratto di tessuto, ecc. Il precipitogeno ha una differenza caratteristica dall'agglutinogeno, che risiede nella dimensione delle particelle di cui è costituito. L'agglutinogeno ha una dimensione cellulare intrinseca, mentre i precipitogeni sono proporzionali alla dimensione della molecola. La soluzione antigenica è caratterizzata da trasparenza.
- Un anticorpo presente nel siero del sangue umano, nonché nel siero diagnostico immunitario, che contiene gli anticorpi studiati.
- Gli elettroliti sono una soluzione di cloruro di sodio, caratterizzata da uno stato isotonico.
Ottenere il precipitogeno
La reazione di precipitazione è impossibile senza il precipitogeno, che si ottiene macinando i materiali ed estraendo da essi gli antigeni proteici. L'estrazione avviene mediante bollitura o altri metodi.
Un esempio lampante di precipitogeni sono i lisati, nonché estratti di tessuti e organi, siero di sangue, vari tipi di filtrati a base di colture di brodo di microbi, nonché estratti salini di microrganismi e sostanze autolisate.
Messa in scena nelle precipitazioni
Ora diamo un'occhiata al metodo per impostare la reazione di precipitazione.
Viene eseguita una reazione di precipitazione dell'anello, che avviene in provette appositamente preparate. Il siero viene introdotto nella cavità della vaschetta, versandolo lungo la parete utilizzando il naso di una pipetta. Successivamente, la quantità appropriata di precipitogeno viene accuratamente stratificata sopra, quindi la provetta viene portata in posizione verticale da orizzontale. Impostare e tenere conto della reazione di precipitazione è un'operazione molto scrupolosa. Il risultato viene preso in considerazione dopo la comparsa di un anello bianco al confine tra antigene e anticorpo. Se gli elementi reattivi della reazione corrispondono tra loro, allora comunicano, ma ciò diventa evidente dopo un lungo periodo di tempo della loro interazione.
La reazione di precipitazione viene effettuata anche in una capsula Petri o su un vetrino, dove viene trasferito il gel di agar, applicandolo in un piccolo strato. Dopo che si è indurito, nel gel vengono ritagliati un piccolo numero di pozzetti in cui verranno inseriti gli antigeni e gli anticorpi. Esistono due modi per eseguire questa azione: il metodo dell'immunodiffusione radiale e quello della doppia immunodiffusione.
informazioni generali
La meccanica della precipitazione è simile al dispositivo di agglutinazione. Quando esposto all'influenza del siero di tipo immunitario, l'antigene che ha già reagito si riduce.Una condizione importante è la trasparenza sia del siero che dell'antigene.
La registrazione di una reazione può essere migliorata stratificando gli antigeni sugli anticorpi. Di conseguenza, si può osservare la comparsa di precipitati a forma di anello. Questo fenomeno è chiamato precipitazione ad anello e viene effettuato in tubi speciali con un diametro compreso tra 2,5 e 3,5 mm. Uno degli esempi più diffusi di reazione da precipitazione è la diagnosi di antrace.
La precipitazione consente di determinare il livello di tossigenicità di una coltura di difterite nell'agar.
Durante la reazione in esame avviene la precipitazione di complessi antigenici e anticorpi. La precipitazione è un fenomeno immunologico che consente di determinare la quantità di anticorpi contenuti nel siero di esseri umani e animali malati o vaccinati.
Conseguenza della titolazione
È importante sapere che i dati ottenuti mediante titolazione con il metodo sopra descritto non sono quantitativi. Per creare e analizzare una stima quantitativa del numero di anticorpi contenuti, M. Heidelberger ed E. Kabat hanno sviluppato una speciale tecnica di reazione, che si basa sulla ricerca e l'identificazione della zona di equivalenza. La miscelazione del numero di antigeni specifico per l'età con un volume costante di antisiero porta ad un aumento del precipitato inizialmente formato, che poi diminuisce nuovamente a causa dell'aumento della capacità di dissolvere i complessi antigenici. Determinando la quantità di anticorpi nei surnatanti contenuti in ciascuna provetta, è possibile scoprire che in un certo numero di piastre con anticorpi non ci sarà liquido. Qui, rispetto ad altre provette, si formerà il precipitato più grande. Grazie a ciò e alla sottrazione del precipitato proteico antigenico dal valore totale delle proteine, è possibile ottenere il valore esatto degli anticorpi contenuti nel volume del siero appositamente studiato. Successivamente, la quantità di molecole proteiche nel precipitato viene determinata dalla quantità di azoto o utilizzando metodi colorimetrici.
Stima dei valori
Una valutazione dei valori di precipitazione nella metodologia diagnostica deve tenere conto della probabilità della presenza nel siero immunitario di un anticorpo che non ha la proprietà della precipitina, il che significa che il precipitato stesso potrebbe non formarsi dopo aver reagito con gli antigeni. L'elenco di tali molecole comprende anticorpi parziali e alcune specie del gruppo delle globuline gamma A.
La reazione di precipitazione in condizioni di laboratorio trova la sua applicazione in vari tipi di modifiche. Ad esempio, la reazione di termoprecipitazione viene utilizzata per rilevare gli antigeni batterici del botulismo, dell'antrace, ecc., che non sono soggetti a denaturazione termica. A differenza della precipitazione ad anello, questo tipo di reazione utilizza filtrati del materiale in questione allo stato bollito.
La precipitazione in una miscela complessa non consente di caratterizzare le proprietà dei singoli elementi della miscela. In tali casi, una persona ricorre al metodo di precipitazione nell'agar e utilizza anche l'immunoelettroferesi.
Precipitazioni diffuse
In quest'area di ricerca esiste il concetto di reazione di precipitazione diffusa (DPR). Si basa sulla capacità degli anticorpi e degli antigeni solubili di diffondere in un gel. La diffusione è la capacità di una molecola di una certa sostanza di penetrare nelle molecole di un'altra, causata dal movimento termico.
Un gel è un sistema di tipo disperso in cui la fase liquida è distribuita uniformemente nella fase solida. Molto spesso, per questa reazione viene utilizzato un gel di agar.
Dopo aver fornito i parametri secondo i quali le molecole possono diffondersi l'una verso l'altra, il loro incontro sarà accompagnato dalla formazione di un complesso antigene + anticorpo. Tale neoplasia può diffondersi mentre si trova nel gel stesso e precipiterà assumendo la forma di una striscia che può essere rilevata ad occhio nudo. Se l'antigene e l'anticorpo sono omologhi, non si formerà una banda.
Creare le condizioni in cui avvenga la diffusione nello strato di agar implica il versamento dei componenti, ma il numero totale di pozzetti e la loro posizione relativa è determinata dal tipo di problema da risolvere. L'RPD offre a una persona la capacità di rilevare e identificare virus isolati sconosciuti testando utilizzando un siero anticorpale noto.
Applicazione
Le precipitazioni sono ampiamente utilizzate non solo nella diagnosi delle malattie, ma trovano applicazione anche nella medicina legale. È difficile immaginare un'analisi in cui sia possibile determinare la specie del sangue, di parte di un organo o di un tessuto rinvenuto su un'arma del delitto che non utilizzi la reazione di precipitazione. Durante questo processo vengono utilizzati sieri precipitanti, ottenuti immunizzando vari animali e uccelli. È importante che il livello del titolo sierico sia almeno 1:10.000 e che abbia anche una specificità sufficiente. Dalla macchia di sangue rilevata o dalla sua crosta, viene preparato un estratto per l'esame fisico. soluzione, che verrà successivamente esposta al siero precipitante. Usando questa reazione, è possibile determinare i tipi di proteine dei tessuti e degli organi sia degli esseri umani che degli animali. L'ottenimento di estratti torbidi obbliga a ricorrere alla precipitazione su agar.
conclusioni
Analizzando le informazioni che abbiamo letto, possiamo concludere che le reazioni di precipitazione sono estremamente importanti per l'uomo, poiché consentono di diagnosticare diversi antigeni mediante anticorpi; questo fenomeno è ampiamente utilizzato anche in medicina legale e consente di identificare il tipo di sangue, tessuto o organo in relazione ad un argomento specifico. Esistono diversi tipi e metodi di precipitazione che vengono utilizzati in base alle esigenze emergenti del problema da risolvere.
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