Лечение генетических болезней. Генная терапия: как лечат генетические заболевания Можно ли излечить генетические заболевания. Генная терапия Генная терапия человека

Порядка двухсот миллионов жителей планеты являются потенциальными кандидатами для генной терапии, а несколько тысяч уже стали пациентами-пионерами и в рамках испытаний получили лечение от ранее неизлечимых заболеваний. Кандидат медицинских наук, врач-терапевт Лаборатории регенеративной медицины Медицинского центра МГУ, старший научный сотрудник Факультета фундаментальной медицины МГУ, победитель «Научных боев» Политеха - 2015 Павел Макаревич объяснил T&P, как работает генная терапия и с какими проблемами сталкиваются ученые, разрабатывая этот принципиально другой метод лечения многих серьезных болезней.

Павел Макаревич

200 миллионов потенциальных кандидатов - это очень много. До половины случаев, в которых помогает генная терапия, это наследственные заболевания: гемофилия, иммунодефициты, болезни накопления, энзимопатия, 25–30% случаев - это онкологические заболевания, оставшиеся 20% - все остальное: кардиология, неврология, болезни нервной системы и даже травмы, например повреждения нерва или другие, более тяжелые случаи. Такое распределение связано с тем, что наследственные заболевания протекают крайне тяжело и зачастую имеют летальный исход, и там нет другого лечения в принципе, за исключением генной терапии.

В качестве лечебного действующего вещества в генной терапии используется генетическая информация, а точнее молекулы, которые ее несут: нуклеиновые кислоты РНК (реже) и ДНК (чаще). В каждой клетке есть «ксерокс» - экспрессионный аппарат - механизм, с помощью которого клетка переводит генетическую информацию в белки, позволяющие ей правильно функционировать. То состояние, когда есть правильный ген и хорошо работающий «ксерокс» (который вообще-то должен работать всегда, иначе такая клетка нежизнеспособна), с точки зрения генной терапии можно условно назвать здоровьем клетки. В любой клетке есть полная библиотека этих оригиналов - генов, которые клетка использует для правильной экспрессии белков и нормального функционирования. При патологии возможны самые различные ситуации. Например, когда по какой-то причине потерян важный оригинал (ген) или большая его часть и восстановить такую потерю уже невозможно. В такой ситуации развиваются такие заболевания, как, например, миодистрофия Дюшенна, которая приводит к прогрессивному параличу всех мышц тела и заканчивается смертью в 25–27 лет - как правило, от остановки дыхания.

Другой пример - небольшая «поломка», не такая фатальная, но тем не менее приводящая к тому, что этот белок не работает - не выполняет своей биологической функции. И если это, например, VIII фактор свертывания крови, то у человека развивается гемофилия. В обеих этих ситуациях наша задача - доставить в ткань «нормальную», рабочую копию гена, то есть как бы подложить в этот «ксерокс» правильный оригинал, чтобы наладить работу клетки и, может быть, целого организма, продлевая таким образом ему жизнь. Работает ли это? Да, такие подходы эффективны в экспериментах на животных и уже проходят стадии клинических испытаний на пациентах, хотя следует признать, что трудностей на пути хватает.

Мы также разрабатываем подходы для лечения ишемических заболеваний, которые гораздо более распространены, чем наследственная патология, хотя, несомненно, для них существует и множество других способов лечения. Дело в том, что каждый человек, который болеет ишемической болезнью сердца или конечностей, рано или поздно оказывается в состоянии, когда единственным способом лечения для него может оказаться генная терапия.

С помощью генной терапии лечится большая группа заболеваний, связанных с поражением центральной нервной системы, - болезнь Паркинсона, Альцгеймер, боковой амиотрофический склероз. Существуют вирусы, которые имеют склонность атаковать центральную нервную систему, и это свойство можно использовать во благо. Например, вирус герпеса живет в нервах, и с его помощью в нервную систему можно доставлять факторы роста и цитокины, которые замедляют развитие этих заболеваний. Это как раз пример того, когда вирус, вызывающий заболевание, редактируется, лишается белков, отвечающих за его патогенное действие, и используется как кассета, а факторы роста защищают нейроны от гибели, которая происходит при этих заболеваниях и становится причиной гибели больного. Таким образом получается, что вирусы, несущие гены факторов роста, замедляют прогресс болезни и продлевают жизнь пациента.

Или, например, слепота - состояние, которое полностью лишает человека зрительных образов на всю жизнь. Одна из причин слепоты - так называемая врожденная атрофия Лебера, которая развивается из-за мутации в гене RPE 65. В мире сейчас уже около 80 людей обрели минимальные зрительные возможности благодаря генной терапии - модифицированному аденовирусу, который доставил «рабочий» RPE 65 в ткани глаза и повысил его чувствительность к свету.

Как мы доставляем генетическую информацию в ткани: локально, в конкретный орган, или сразу в весь организм? Есть два варианта. Первый - это плазмида, то есть кольцевая молекула ДНК. Она супер спирализуется, становится очень маленькой и компактной, и мы «упаковываем» ее в какой-нибудь химический полимер, чтобы облегчить ее проникновение в клетку. В чем здесь проблема? Плазмидная ДНК через 12–14 дней будет удалена из клетки, и продукция белка остановится. В такой ситуации мы можем предпринять два решения: первое - ввести дополнительную дозу плазмидной ДНК (благо она не иммуногенна), второе - ввести туда сразу несколько генов (например, для усиления эффектов цитокинов на регенерацию ткани), чтобы увеличить силу действия в тот короткий период времени, в течение которого будет идти продукция белков.

Другой выход (о нем мы уже упоминали выше) - это вирусы. Изначально вирусы - патогенные частицы, вызывающие заболевания, но в нашем случае они могут использоваться и для доставки генетической информации в клетки. С помощью методов генетической инженерии мы можем убрать у вируса белки, отвечающие за его патогенное действие, оставив ему лишь то, что необходимо для проникновения в клетку, и нагрузив нужной нам информацией. Тогда вирус из оружия превращается в кассету для доставки полезной, лечебной генетической информации.

Получается, что у нас есть два очень мощных способа доставки гена, и вирус явно выглядит более предпочтительным, потому что он сам может находить свои мишени в организме: например, вирус гепатита найдет печень, а вирус герпеса - нейроны. Плазмида, кольцевая ДНК, работает только там, куда ее ввели. Возникает вопрос: почему мы до сих пор вообще пользуемся плазмидами, если есть вирусы? Ответ такой: вирусы иммуногенны, они вызывают иммунный ответ. И, как вариант, они могут быть либо уничтожены иммунной системой до того, как успеют сработать, либо, как худший вариант, они могут вызывать побочные действия - мощные иммунные реакции на введение вируса. Получается очень хрупкий баланс между эффективностью и безопасностью, который определяет судьбу препаратов, которые мы разрабатываем, и, если препарат показал себя небезопасным на этапе разработки, это тупик.

Чтобы разработать, получить и протестировать новый препарат для генной терапии, лаборатория или даже целый институт должны работать несколько лет. Это, мягко говоря, недешево, пока это штучное производство, и протоколы, если они не спонсируются разработчиком, очень дорогие. Есть два или три препарата, зарегистрированных в Европе, один в Японии, в России пока только один - «Неоваскулген», препарат для стимуляции роста сосудов.

Препараты, которые используются для генной терапии, имеют не изученную ранее фармакокинетику, фармакодинамику. Вся проблема в том, что на данный момент об этом накоплено очень мало информации по сравнению с тем, сколько ее вокруг обычных препаратов. Это означает, что все риски, связанные с генной терапией, теоретически должны учитываться при разработках. Допустим, мы знаем, что не нужно испытывать тысячекратную дозу аспирина на практике, и мы этого не делаем. В отношении генной терапии, поскольку мы пока не знаем фармакокинетику (а значит, и многих особенностей действия препаратов), мы должны учитывать все существующие возможные эффекты, и это сильно растягивает исследование во времени.

Вторая проблема заключается в том, что каждый препарат имеет свой уникальный тип действия. Это означает, что нужно доказывать его безопасность и эффективность на уникальных моделях, а это тоже растягивает период, после которого можно сказать: «Да, лекарство может быть выведено в клинику или на рынок, и это безопасно». Поэтому я считаю, что это во многом вопрос времени и опыта человечества в этой области, который, как и в любом drug-девелопменте, будет накапливаться ценой больших проблем: остановленных исследований, побочных эффектов. Но я также знаю, что это вопрос затраченных усилий сотен исследователей и потенциальный способ помочь миллионам людей. В настоящее время уже накоплен опыт и извлечены некоторые уроки, которые помогают идти дальше.

16886 0

Установление локализации и последовательности гена, мутации которого вызывают конкретные заболевания, а также самой мутации и современные способы ее тестирования позволяют диагностировать заболевание в нео- и даже пренатальный период развития организма. Это дает возможность смягчить проявление генетического дефекта с помощью медикаментозного лечения, диеты, переливания крови и т.д.

Однако такой подход не приводит к исправлению самого дефекта и, как правило, наследственные заболевания не излечиваются. Ситуация осложняется еще и тем, что мутация одного гена может давать самые разные последствия на организм. Если мутация гена вызывает изменения активности фермента, который он кодирует, то это может привести к накоплению токсичного субстрата или, наоборот, к дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки.

Хорошо известным примером такого заболевания является фенилкетонурия. Его вызывает мутация в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, катализирующего превращение фенилаланина в тирозин. В результате повышается уровень эндогенного фенилаланина в крови, что вызывает неправильное формирование миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных клеток центральной нервной системы и, как следствие, тяжелую умственную отсталость.

Если мутация затрагивает ген структурного белка, то это может приводить к серьезным нарушениям на уровне клеток, тканей или органов. Примером такого заболевания является кистозный фиброз.

Делеция в гене, кодирующем белок, который называется транспортер кистозного фиброза, приводит к синтезу дефектного белка (отсутствие фенилаланина 508) и нарушениям транспорта ионов хлора сквозь клеточные мембраны. Одним из наиболее вредных последствий этого является то, что слизь, которая выстилает и защищает легкие, становится ненормально густой. Это затрудняет доступ к клеткам легких и способствует накоплению вредных микроорганизмов. Клетки, выстилающие воздухоносные пути легких, погибают и заменяются фиброзной рубцовой тканью (отсюда название болезни). В результате пациент погибает от нарушения дыхания.

Наследственные заболевания отличаются сложными клиническими проявлениями, и их традицинное лечение имеет в основном симптоматический характер: для лечения фенилкетонурии назначают безаланиновую диету, дефектные белки заменяют функциональным внутривенным введением, для компенсации утраченных функций проводят трансплантацию костного мозга или других органов. Все эти меры, как правило, малоэффективны, дороги, длительны, и лишь немногие пациенты доживают до старости. Поэтому разработка принципиально новых видов терапии очень актуальна.

Генная терапия

Генной терапией называется генетическая инженерия соматических клеток человека, направленная на исправление генетического дефекта, вызывающего заболевание. Коррекция специфического заболевания осуществляется путем введения в дефектные соматические клетки нормальных экспрессирующихся генов. К 80-м гг., когда были разработаны методы получения отдельных генов и созданы эукариотические экспрессирующие векторы, стали рутинными эксперименты по переносу генов на мышах, перспективы генной коррекции стали реальными.

В 1990 г. в США доктором У. Френч Андерсоном (W. French Andrson) были предпринята первая попытка генотерапии для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) у трехлетней девочки Ашанти де Силва (Ashanthi da Silva). Это заболевание вызывается мутацией в гене, кодирующем аденозанаденилазу (АДА). Дефицит этого фермента способствует накоплению в крови аденозина и дезоксиаденозина, токсическое действие которых приводит к гибели В- и Т-лимфоцитов периферической крови и, как следствие, иммунодефициту.

Дети с таким заболеванием должны быть защищены от любых инфекций (содержаться в специальных стерильных камерах), поскольку любая болезнь может оказаться смертельной. Через 4 года после начала лечения у ребенка наблюдалась экспрессия нормально функционирующей АДА и облегчение симптомов ТКИД, что позволило ей покинуть стерильную камеру и жить нормальной жизнью.

Таким образом, была продемонстрирована принципиальная возможность успешной генетической терапии соматических клеток. Начиная с 90-х гг. проходят испытания генной терапии целого ряда генетических заболеваний, среди которых такие тяжелейшие, как гемофилия, СПИД, разные виды злокачественных новообразований, муковисцидоз и др. На данный момент поддаются излечению с помощью трансгенеза уже около 10 болезней человека.

Разнообразие генетических заболеваний предопределило развитие множества подходов генной терапии. При этом решаются 2 главные проблемы: средство доставки терапевтического гена; способ обеспечения адресной доставки к клеткам, предназначенным для коррекции. К настоящему времени все подходы к генной терапии соматических клеток можно разделить на две категории: терапия ex vivo и in vivo (рис. 3.15).

Рис. 3.15. Схема проведения генной терапии ex vivo (а) и in vivo (а)

Генная терапия ex vivo предполагает генетическое исправление дефектных клеток вне организма с последующим возвращением нормально функционирующих клеток в организм.

Генная терапия in vivo предусматривает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента. Рассмотрим эти подходы подробнее.

Генная терапия ex vivo включает следующие этапы:
1) получение дефектных клеток больного и их культивирование;
2) перенос нужного гена в изолированные клетки с помощью трансфекции терапевтической генной конструкции;
3) отбор и наращивание генетически исправленных клеток;
4) трансплантация или трансфузия этих клеток пациенту.

Использование собственных клеток пациента гарантирует, что после их возвращения у него не разовьется иммунный ответ. Процедура переноса генной конструкции должна быть эффективной, а нормальный ген должен стабильно поддерживаться и непрерывно экспрессироваться.

Средством переноса генов, созданного самой природой, являются вирусы. С целью получения эффективных векторов для доставки генов в основном используют две группы вирусов - аденовирусы и ретровирусы (рис. 3.16). В генной терапии применяют варианты генетически обезвреженных вирусов.

Рис. 3.16. Вирусы, применяемые для создания терапевтических векторов

Рассмотрим устройство и использование конструкций на основе ретро-вирусов. Напомним, что геном ретровируса представлен двумя идентичными одноцепочечными молекулами РНК, каждая из которых состоит из шести участков: два длинных концевых повтора (LTR) на 5" и 3" концах, некодирующая последовательность *Р+, необходимая для упаковки РНК в вирусную частицу, и три участка, кодирующих структурный белок внутреннего капсида (gag), обратную транскриптазу (pol) и белок оболочки (env) (рис. 3.17, а).

Рис. 3.17. Генетическая карта типичного ретровируса (а) и карта ретровирусного вектора (а)

Напомним, что жизненный цикл ретровируса включает следующие стадии:
1. Инфицирование клеток-мишени.
2. Синтез ДНК копии генома с помощью собственной обратной транскриптазы.
3. Транспорт вирусной ДНК в ядро.
4. Встраивание вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина.
5. Транскрипция мРНК с вирусной ДНК под контролем сильного промотора, локализованного на участке 5"-LTR.
6. Трансляция белков Gag, Pol и Env.
7. Образование вирусного капсида и упаковки двух РНК-цепей и молекул обратной транскриптазы.
8. Высвобождение вирионов из клетки.

При получении ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретро-вируса встраивают в плазмиду, удаляют большую часть гена gag и полностью гены pol и env, а вместо них встраивают «терапевтический» ген Т и при необходимости маркерный селективный ген Rg с собственным промотором (рис. 3.17, б). Транскрипция гена Т будет контролироваться все тем же сильным промотором, локализованным на 5"-LTR участке. На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы и максимальный размер ДНК-вставки примерно 8 тыс. п.о.

Полученную таким образом конструкцию можно саму по себе использовать для трансформации, но ее эффективность и последующая интеграция в геном клетки-хозяина крайне низки. Поэтому была разработана методика упаковки полноразмерной РНК ретровирусного вектора в интактные вирусные частицы, которые с высокой частотой проникают в клетку и гарантированно встраиваются в геном хозяина. Для этого была создана так называемая «пакующая» клеточная линия. В двух разных участках хромосом этих клеток вшиты ретровирусные гены gag и pol-env, лишенные способности паковаться из-за отсутствия последовательности + (84*+) (рис. 3.18).

Рис. 3.18. Схема получения упакованного вирусного вектора

То есть оба эти фрагмента транскрибируются, но при этом образуются лишенные РНК пустые капсиды. При трансфекции РНК вирусного вектора в такие клетки она встраивается в хромосомную ДНК и транскрибируется с образованием полноразмерной РНК ретровируса, и в таких условиях в капсидах упаковывается только РНК вектора (только в ней имеется +-последовательность). Образующиеся интактные вирусные частицы используют для эффективной доставки ретровирусного вектора в клетки-мишени.

Ретровирусы активно инфицируют только интенсивно делящиеся клетки. Для переноса генов их обрабатывают очищенными частицами упакованного ретровирусного вектора или совместно культивируют с производящей их клеточной линией, а затем осуществляют селекцию для разделения клеток-мишеней и пакующих клеток.

Трансдуцированные клетки тщательно проверяют на уровень синтеза продукта терапевтического гена, отсутствие компетентных по репликации ретровирусов, отсутствие изменений способности клеток к росту или функционированию.

Наиболее пригодными для проведения генной терапии являются клетки костного мозга. Это связано с наличием в нем тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые могут пролиферировать и дифференцироваться в различные типы клеток -В- и Т-лимфоциты, макрофаги, эритроциты, тромбоциты и остеокласты. Именно эти клетки применяют для лечения целого ряда наследственных заболеваний, среди них уже упомянутый нами тяжелый комбинированный иммунодефицит, болезнь Гоше, серповидноклеточная анемия, талассемия, остеопороз и др.

Помимо тотипотентных стволовых клеток костного мозга, которые трудно выделять и культивировать, используют стволовые клетки из пупoвинной крови (предпочтительное использование для генотерапии новорожденных), а также клетки печени - гепатоциты - для лечения гиперхолестеролемии.

При генной терапии in vivo особенно важно обеспечить доставку терапевтического гена к дефектным клеткам. Такую адресную доставку могут обеспечить модифицированные векторы, созданные на основе вирусов, способных инфицировать специфические виды клеток. Рассмотрим подход, разработанный для лечения уже упомянутого выше кистозного фиброза. Поскольку легкие являются открытой полостью, терапевтические гены к ним доставить относительно легко. Клонированный вариант здорового гена был введен в инактивированный аденовирус (рис. 3.19). Специфика этого типа вируса заключается в том, что он инфицирует выстилку легких, вызывая простуду.

Рис. 3.19. Схема получения вектора на основе аденовируса

Сконструированный таким образом вирус испытывали, распыляя его в нос и легкие экспериментальных животных, а затем людей-пациентов. В некоторых случаях наблюдалось введение и экспрессия здорового гена, и восстановление нормального переноса ионов хлора. Возможно, этот подход (введение нормального гена с помощью носовых аэрозолей) в ближайшем будущем будет широко использоваться для лечения симптомов кистозного фиброза в легких.

Кроме ретро- и аденовирусов в экспериментах по генной терапии используют и другие типы вирусов, например вирус Herpes simplex. Особенностью этого двунитевого (152 тыс. п.о.) ДНК-вируса является его способность специфически поражать нейроны. Известно множество генетических заболеваний, поражающих центральную и периферическую нервную систему - опухоли, метаболические нарушения, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона).

Вирус простого герпеса I типа (HSV) является весьма подходящим вектором для терапии таких заболеваний. Капсид этого вируса сливается с мембраной нейрона, и его ДНК транспортируется в ядро. Предложено несколько способов переноса терапевтического гена с помощью HSV-векторов и проведены успешные испытания на экспериментальных животных.

Вирусные векторы имеют несколько недостатков: высокая стоимость, ограниченная клонирующая емкость и возможная воспалительная реакция. Так, в 1999 г. в результате развившегося необычайно сильного иммунного ответа на введение аденовирусного вектора погиб 18-летний доброволец, принимавший участие в испытаниях препарата. В 2002 г. у двух детей во Франции во время лечения от иммунодефицита (введением терапевтических генов в стволовые клетки с помощью ретровирусов) развилось состояние, похожее на лейкемию.

Поэтому разрабатываются невирусные системы доставки генов. Самый простой и неэффективный способ - это инъекция плазмидной ДНК в ткани. Второй подход - это бомбардировка тканей микрочастицами золота (1-3 мкм), конъюгированными с ДНК. При этом терапевтические гены экспрессируются в тканях-мишенях и их продукты - терапевтические белки - поступают в кровь. Основным недостатком этого подхода является преждевременная инактивация или разрушение этих белков компонентами крови.

Доставку ДНК можно осуществить, упаковав ее в искусственную липидную оболочку. Полученные таким образом сферические частицы-липосомы легко проникают через клеточную мембрану. Созданы липосомы с самыми разными свойствами, однако пока эффективность такой доставки невысока, поскольку большая часть ДНК подвергается лизосомному разрушению. Также для доставки генетической конструкции синтезируют конъюгаты ДНК с различными молекулами, способными обеспечить ее сохранность, адресную доставку и проникновение в клетку.

В последние годы проводятся интенсивные эксперименты по созданию искусственной 47-й хромосомы, которая позволила бы включить большое количество генетического материала с полным набором регуляторных элементов для одного или нескольких терапевтических генов. Это дало бы возможность использовать геномный вариант терапевтического гена и тем самым обеспечить его стабильность и эффективную длительную экспрессию. Проведенные эксперименты показали, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей терапевтические гены, вполне реально, однако пока непонятно, каким образом вводить такую огромную молекулу в ядро клетки-мишени.

Основными проблемами, которые стоят перед генной терапией, помимо риска тяжелой иммунной реакции, являются трудности длительного хранения и функционирования терапевтической ДНК в организме пациента, мультигенность многих болезней, делающая их трудной мишенью для генной терапии, а также риск использования вирусов в качестве векторов.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова

Введение

С каждым годом в научных журналах появляется всё больше статей о медицинских клинических исследованиях, в которых, так или иначе, применялось лечение, основанное на введении различных генов - генная терапия. Это направление выросло из таких хорошо развивающихся разделов биологии, как молекулярная генетика и биотехнология.

Зачастую, когда обычные (консервативные) методы уже перепробованы, именно генная терапия может помочь пациентам выжить и даже полностью выздороветь. Например, это касается наследственных моногенных заболеваний, то есть таких, которые вызваны дефектом в одном-единственном гене, а также и многих других . Или, к примеру, генная терапия может выручить и спасти конечность тем больным, у которых сужен просвет сосудов в нижних конечностях и вследствие этого развилась стойкая ишемия окружающих тканей, то есть эти ткани испытывают сильный недостаток питательных веществ и кислорода, которые в норме разносятся кровью по организму . Хирургическими манипуляциями и лекарствами таких пациентов лечить зачастую не получается, зато если локально заставить клетки выбрасывать наружу больше белковых факторов, которые повлияли бы на процесс образования и прорастания новых сосудов, то ишемия стала бы гораздо менее выраженной и жить больным станет гораздо легче.

Генную терапию сегодня можно определить как лечение заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты совсем недавно - 22 мая 1989 года в целях диагностики рака. Первым наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммуннодефицит .

С каждым годом число успешно проведенных клинических испытаний лечения различных заболеваний с использованием генной терапии растёт, и к январю 2014 г. достигло 2 тысяч .

Вместе с тем и в современных исследованиях по генной терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирования генами или «перетасованными» (рекомбинантными) ДНК in vivo (лат. буквально "в живом") изучены недостаточно. В странах с наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области, особенно в США, медицинские протоколы с использованием смысловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экспертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. В США таковыми являются Консультативный комитет по рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory Committee, RAC) и Управление по лекарствам и пищевым продуктам (Food and Drug Administration, FDA) с последующим обязательным утверждением проекта директором Национальных институтов здоровья (National Institutes of Health) .

Итак, мы определились, что данное лечение основано на том, что если какие-то ткани организма испытывают недостаток некоторых отдельных белковых факторов, то это можно исправить введением в эти ткани соответствующих генов, кодирующих белки, и всё станет более или менее замечательно. Сами белки вводить не получится, потому что наш организм тут же среагирует неслабой иммунной реакцией, да и длительность действия была бы недостаточной. Теперь следует определиться с методом доставки гена в клетки.

Трансфекция клеток

Для начала стоит ввести определения некоторых терминов.

Транспорт генов осуществляется благодаря вектору - это молекула ДНК, используемая как «транспортное средство» для искусственного переноса генетической информации в клетку. Выделяют множество разновидностей векторов: плазмидные, вирусные, а также космиды, фазмиды, искусственные хромосомы и т.д. Принципиально важно, что векторы (в частности, плазмидные) обладают характерными для них свойствами:

1. Точка начала репликации (ori) - последовательность нуклеотидов, с которой начинается удвоение ДНК. Если векторная ДНК не сможет удваиваться (реплицироваться), то необходимый лечебный эффект не будет достигнут, потому что она просто быстро расщепится внутриклеточными ферментами-нуклеазами, а из-за недостатка матриц будет в итоге образовано гораздо меньше молекул белка. Следует отметить, что эти точки специфичны для каждого биологического вида, то есть если векторную ДНК предполагается получать путём её размножения в культуре бактерий (а не просто химическим синтезом, что обычно гораздо дороже), то потребуются отдельно две точки начала репликации - для человека и для бактерий;

2. Сайты рестрикции - специфические короткие последовательности (чаще палиндромные), которые узнаются специальными ферментами (эндонуклеазы рестрикции) и разрезаются ими определённым образом - с образованием «липких концов» (рис.1).

Рис.1 Образование "липких концов" с участием рестриктаз

Эти сайты необходимы для того, чтобы сшить векторную ДНК (которая, по сути, является «болванкой») с нужными терапевтическими генами в единую молекулу. Такая сшитая из двух или нескольких частей молекула зовётся «рекомбинантной»;

3. Понятно, что нам желательно бы получить миллионы копий рекомбинантной молекулы ДНК. Опять-таки, если мы имеем дело с культурой клеток бактерий, то далее эту ДНК нужно выделить. Проблема заключается в том, что далеко не все бактерии проглотят нужную нам молекулу, некоторые не станут этого делать. Чтобы эти две группы всё-таки различить, в векторную ДНК вставляют селективные маркёры - участки устойчивости к определённым химическим веществам; теперь если в среду добавить эти самые вещества, то выживут только те, которые обладают устойчивостью к ним, а остальные погибнут.

Все эти три составляющие можно наблюдать и в самой первой искусственно синтезированной плазмиде (рис.2).

Рис.2

Сам процесс внедрения плазмидного вектора в определённые клетки называется трансфекцией . Плазмида - это довольно короткая и обычно кольцевая молекула ДНК, которая находится в цитоплазме бактериальной клетки. Плазмиды не связаны с бактериальной хромосомой, они могут реплицироваться независимо от нее, могут выбрасываться бактерией в окружающую среду или, наоборот, поглощаться (процесс поглощения - трансформация ). С помощью плазмид бактерии могут обмениваться генетической информацией, например, передавать устойчивость к определённым антибиотикам.

Плазмиды существуют в бактериях в естественных условиях. Но никто не может помешать исследователю искусственно синтезировать плазмиду, которая будет обладать нужными для него свойствами, вшить в нее ген-вставку и внедрить в клетку. В одну и ту же плазмиду можно вшивать разные вставки .

Методы генной терапии

Существует два основных подхода, различающиеся природой клеток-мишеней:

1. Фетальная, при которой чужеродную ДНК вводят в зиготу (оплодотворённую яйцеклетку) или эмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается, что введённый материал попадёт во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самым передачу следующему поколению). В нашей стране она фактически запрещена ;

2. Соматическая, при которой генетический материал вводят уже родившемуся в неполовые клетки и он не передаётся половым клеткам.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных (размноженных) и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в определённые ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения лёгочных заболеваний (муковисцидоз, рак легких).

Разработке программы генной терапии предшествует много этапов. Это и тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена (т. е., синтеза на матрице гена какого-то белка в определённой ткани), и идентификация первичного биохимического дефекта, и исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола.

Важно, что при составлении схем коррекции генов оценивается эффективность трансфекции, степень исправления первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro, "в пробирке") и, что особенно важно, in vivo на животных - биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний .

Прямая доставка и клеточные носители терапевтических генов

Существует множество методов внедрения чужеродной ДНК в эукариотическую клетку: некоторые зависят от физической обработки (электропорация, магнетофекция и т.д.), другие - от применения химических материалов или биологических частиц (например, вирусов), которые используются как переносчики. Сразу стоит оговориться, что обычно комбинируются химические и физические методы (например, электропорация + окутывание ДНК липосомами)

Прямые методы

1. Трансфекция на химической основе может быть классифицирована на несколько видов: с использованием вещества циклодекстрина, полимеров, липосом или наночастиц (с или без химической или вирусной функционализации, т.е. модификации поверхности).
а) Один из самых дешевых методов - использование фосфата кальция. Он повышает эффективность включения ДНК в клетки в 10-100 раз. ДНК образует с кальцием прочный комплекс, что обеспечивает его эффективное поглощение. Недостаток - ядра достигает всего около 1 - 10% ДНК. Метод используется in vitro для переноса ДНК в клетки человека (рис.3);

Рис.3

б) Применение сильноразветвленных органических молекул - дендример, для связывания ДНК и переноса её в клетку (рис.4);

Рис.4

в) Очень эффективным методом для трансфекции ДНК является внедрение её через липосомы - малые, окруженные мембраной тельца, которые могут сливаться с клеточной цитоплазматической мембраной (ЦПМ), представляющая собой двойной слой из липидов. Для эукариотических клеток трансфекция производится эффективнее с применением катионных липосом, потому что клетки к ним более чувствительны. Процесс имеет своё название - липофекция. Этот метод сегодня считается одним из самых безопасных. Липосомы нетоксичны и неиммуногенны. Однако, эффективность переноса генов с помощью липосом ограничена, поскольку внесенная ими ДНК в клетках обычно сразу же захватывается лизосомами и разрушается. Введение ДНК в клетки человека с помощью липосом сегодня является главным при терапии in vivo (рис.5);

Рис.5

г) Еще один метод - использование катионных полимеров, таких как диэтиламиноэтил-декстран или полиэтиленимин. Отрицательно заряженные молекулы ДНК связываются с положительно заряженными поликатионами, и этот комплекс далее проникает в клетку путём эндоцитоза. ДЭАЭ-декстран изменяет физические свойства плазматической мембраны и стимулирует поглощение этого комплекса клеткой. Главный недостаток метода заключается в том, что ДЭАЭ-декстран в высоких концентрациях токсичен. Метод не получил распространения в генотерапии;

д) С помощью гистонов и других ядерных белков. Эти белки, содержащие много положительно заряженных аминокислот (Lys, Arg), в естественных условиях помогают компактно уложить длинную цепь ДНК в сравнительно небольшое ядро клетки.

2. Физические методы:

а) Электропорация - очень популярный метод; мгновенное повышение проницаемости мембраны достигается за счет того, что клетки подвергаются коротким воздействиям интенсивного электрического поля. Показано, что в оптимальных условиях количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. На человеке на сегодняшний день не используется (рис.6).

Рис.6

б) «Cell squeezing» - метод, изобретенный в 2013 г. Он позволяет доставить молекулы в клетки путём "мягкого сдавливания" клеточной мембраны. Метод исключает возможность токсичности или неправильного попадания по мишени, так как он не зависит от внешних материалов или электрических полей;

в) Сонопорация - метод искусственного переноса чужеродных ДНК в клетки с помощью воздействия на них ультразвуком, вызывающим открывание пор в клеточной мембране;
г) Оптическая трансфекция - метод, при котором производится крошечное отверстие в мембране (около 1 мкм в диаметре) при использовании сильносфокусированного лазера;
д) Гидродинамическая трансфекция - метод доставки генетических конструкций, белков и т.д. путем контролируемого повышения давления в капиллярах и межклеточной жидкости, что вызывает кратковременное повышение проницаемости клеточных мембран и образование в них временных пор. Осуществляется быстрой инъекцией в ткань, доставка при этом является неспецифичной. Эффективность доставки для скелетной мышцы - от 22 до 60% ;

е) Микроинъекция ДНК - введение в ядро клетки животных с помощью тонких стеклянных микротрубочек (d=0,1-0,5 мкм). Недостаток - сложность метода, высока вероятность разрушения ядра либо ДНК; можно трансформировать ограниченное число клеток. Не используется для человека.

3. Методы на основе частиц.

а) Прямой подход к трансфекции - генная пушка, при этом ДНК сцепляют в наночастицу с инертными твердыми веществами (чаще золото, вольфрам), которая затем «выстреливает» направленно в ядра клеток-мишеней. Этот метод применяется in vitro и in vivo для введения генов, в частности, в клетки мышечных тканей, например при таком заболевании, как миодистрофия Дюшена. Размеры частиц золота - 1-3 мкм (рис.7).

Рис.7

б) Магнитофекция - метод, использующий силы магнетизма для доставки ДНК в клетки-мишени. Сначала нуклеиновые кислоты (НК) ассоциируются с магнитными наночастицами, а далее, под действием магнитного поля, частицы загоняются в клетку. Эффективность почти 100%-ная, отмечена явная нетоксичность. Уже через 10-15 мин частицы регистрируются в клетке - это гораздо быстрее других методик.
в) Импалефекция (impalefection; "impalement", букв. "сажание на кол" + "infection") - метод доставки с применением наноматериалов, таких как углеродные нанотрубки и нановолокна. При этом клетки буквально протыкаются подстилкой из нанофибрилл . Приставка «нано» применяется для обозначения их очень маленьких размеров (в пределах миллиардных долей метра) (рис.8).

Рис.8

Отдельно стоит выделить такой метод, как РНК-трансфекция: в клетку доставляется не ДНК, а молекулы РНК - их «преёмники» в цепи биосинтеза белка; при этом активизируются специальные белки, разрезающие РНК на короткие фрагменты -- т.н. малые интерферирующих РНК (миРНК). Эти фрагменты связываются с другими белками и, в конце концов, это приводит к угнетению экспрессии клеткой соответствующих генов. Таким образом можно заблокировать в клетке действие тех генов, которые потенциально на данный момент приносят больше вреда, чем пользы. Широкое применение РНК-трансфекция нашла, в частности, в онкологии.

Основные принципы доставки генов с использованием плазмидных векторов рассмотрены. Теперь можно перейти к рассмотрению вирусных методов. Вирусы - это неклеточные формы жизни, чаще всего представляющие собой молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), обёрнутой в белковую оболочку. Если вырезать из генетического материала вируса все те последовательности, которые вызывают возникновение заболеваний, то весь вирус также можно успешно превратить в «транспортное средство» для нашего гена.

Процесс внедрения ДНК в клетку, опосредованное вирусом, называется трансдукцией .
На практике чаще всего используют ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы (AAV). Для начала стоит разобраться, каким должен быть идеальный кандидат для трансдукции среди вирусов. Критерии таковы, что он должен быть:

Стабилен;
. ёмок, то есть вмещать достаточное количество ДНК;
. инертным в отношении метаболических путей клетки;
. точным - в идеале, должен встраивать свой геном в конкретный локус генома ядра хозяина и др.

В реальной жизни очень сложно скомбинировать хотя бы несколько пунктов, так что обычно выбор происходит при рассмотрении каждого индивидуального случая в отдельности (рис.9).

Рис.9

Из всех трёх перечисленных наиболее используемых вирусов самыми безопасными и одновременно самыми точными являются AAV. Их почти что единственный недостаток - сравнительно малая ёмкость (ок. 4800 п.н.), которая, однако, оказывается достаточной для многих генов .

Помимо перечисленных методов достаточно часто генная терапия применяется в комбинации с клеточной: при этом сначала в питательную среду высаживают культуру определённых клеток человека, после этого тем или иным способом внедряют в клетки нужные гены, некоторое время культивируют и снова пересаживают в организм хозяина. В результате клеткам можно вернуть их нормальные свойства. Так, к примеру, модифицировали белые клетки крови человека (лейкоциты) при лейкемии (рис.10).

Рис.10

Судьба гена после его попадания в клетку

Так как с вирусными векторами всё более-менее ясно в силу их свойства более эффективно доставлять гены до конечной цели - ядра, то остановимся на судьбе плазмидного вектора.

На данном этапе мы добились того, что ДНК прошла первый большой барьер - цитоплазматическую мембрану клетки.

Далее, в комплексе с другими веществами, оболочкой или без, ей необходимо достигнуть клеточного ядра, чтобы специальный фермент - РНК-полимераза - синтезировала молекулу информационной РНК (иРНК) на матрице ДНК (этот процесс называется транскрипция ). Только после этого иРНК выйдет в цитоплазму, образует комплекс с рибосомами и согласно генетическому коду синтезируется полипептид - например, фактор роста сосудов (VEGF), который начнёт выполнять определённую терапевтическую функцию (в данном случае - запустит процесс образования ветвлений сосудов в ткани, подверженной ишемии).

Что касается экспрессии введенных генов в требуемом типе клеток, то эта задача решается с помощью регуляторных элементов транскрипции. Ткань, в которой происходит экспрессия, часто определяется комбинацией специфичного для этой ткани энхансера («усиливающей» последовательности) с определенным промотором (последовательность нуклеотидов, с которой РНК-полимераза начинает синтез), который может быть индуцируемым . Известно, что активность генов можно модулировать in vivo внешними сигналами, а так как энхансеры могут работать с любым геном, то в вектора можно вводить еще инсуляторы, которые помогают энхансеру работать независимо от его положения и могут вести себя как функциональные барьеры между генами. Каждый энхансер содержит набор участков связывания активирующих или супрессирующих белковых факторов . С помощью промоторов можно также регулировать уровень экспрессии генов. Например, есть металлотионеиновые или температурочувствительные промоторы; промоторы, управляемые гормонами.

Экспрессия гена зависит от его положения в геноме. В большинстве случаев существующие вирусные методы приводят лишь к случайному встраиванию гена в геном. Чтобы исключить такую зависимость, при конструировании векторов снабжают ген известными нуклеотидными последовательностями, которые позволяют гену экспрессироваться независимо от места его встраивания в геном.

Наиболее простой путь регуляции экспрессии трансгена - это обеспечение его индикаторным промотором, который чувствителен к физиологическому сигналу, такому, как выделение глюкозы или гипоксия. Такие «эндогенные» контролирующие системы могут быть полезны в некоторых ситуациях, таких, как осуществление глюкозозависимого контроля продукции инсулина. Более надежны и универсальны «экзогенные» системы контроля, когда экспрессия гена контролируется фармакологически введением маленькой лекарственной молекулы. В настоящее время известны 4 основные системы контроля - регулируемые тетрациклином (Tet), стероидом насекомых, экдизоном или его аналогами, антипрогестиновым препаратом майфпристоном (RU486) и химическими димеризаторами, такими, как рапамицин и его аналоги. Все они включают лекарственно зависимое привлечение домена активации транскрипции к основному промотору, ведущему нужный ген, но отличаются по механизмам этого привлечения .

Заключение

Обзор данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные системы далеки от совершенства . Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем - стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность - все еще нуждаются в серьезных доработках.

Прежде всего, это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительному пребыванию внутри ядер). В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.

Генная и клеточная терапия открывает блестящие перспективы для восстановления утраченных клеток и тканей и генно-инженерного конструирования органов, что, несомненно, существенно расширит арсенал методов для медико-биологических исследований и создаст новые возможности для сохранения и продления жизни человека .

Генотерапия - совокупность генноинженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний. Это новая и бурно развивающаяся область, ориентированная на исправление дефектов, вызванных мутациями (изменениями) в структуре ДНК, или придания клеткам новых функций.

Концепция генотерапии, появилась сразу после открытия явления трансформации у бактерийи изучения механизмов трансформации клеток животных опухолеобразующимивирусами. Такие вирусы могут осуществлять стабильное внедрение генетического материала вгеномклетки хозяина, поэтому было предложено использовать их в качествевекторовдля доставки желаемой генетической информации в геном клеток. Предполагалось, что такие векторы могут в случае необходимости поправлять дефекты генома.

Реальностью генная коррекция соматических клеток стала после 1980-х годов, когда были разработаны методы получения изолированных генов, созданы эукариотические экспрессирующие векторы, стали обычными переносы генов у мышей и других животных.

Исторически генная терапия нацеливалась на лечение наследственных генетических заболеваний, однако поле её применения, по крайней мере теоретически, расширилось. В настоящее время генную терапию рассматривают как потенциально универсальный подход к лечению широкого спектра заболеваний, начиная от наследственных, генетических и заканчивая инфекционными.

К генно-терапевтическим подходам теперь относят также и такие подходы, когда клетки модифицируют, чтобы усилить иммунный ответорганизма на нежелательные явления, вызванные инфекцией или возникновением опухолей. Модификация также осуществляется введением новой генетической информации либо в клетки, против которых хотят увеличить иммунный ответ, либо в клетки иммунной системы, с помощью которых хотят усилить этот эффект. Хотя строго говоря эта стратегия не совсем вписывается в классическое понятие генной терапии.

Главной проблемой является преодоление барьеров для проникновения терапевтического агента в опухоль с минимальной токсичностью для здоровых клеток. Модели дают очень обещающие результаты, однако даже с лучшими животными моделями остается проблема перехода к человеку, который отличается и биохимически и физиологически от модели.

3. Роль мелатонина в формировании суточной, сезонной ритмичности, и в адаптации к сезонным изменениям. Влияние мелатонина на репродуктивную функцию млекопитающих и на характер индивидуального развития. Основные этапы онтогенеза на которых изменяется продукция мелатонина, их значение.

Основные функции: Регулирует деятельность эндокринной системы, кровяное давление, периодичность сна, регулирует сезонную ритмику у многих животных, замедляет процессы старения, усиливает эффективность функционирования иммунной системы, обладает антиоксидантными свойствами, влияет на процессы адаптации при смене часовых поясов, кроме того, мелатонин участвует в регуляции, кровяного давления, функций пищеварительного тракта, работы клеток головного мозга.

Влияние на сезонную ритмику и размножение

Так как продукция мелатонина зависит от длины светового дня, многие животные используют ее как «сезонные часы». У людей, как и у животных, продукция мелатонина летом меньше, чем зимой. Таким образом, мелатонин может регулировать функции, зависящие от фотопериода - размножение, миграционное поведение, сезонную линьку. У видов птиц и млекопитающих, которые размножаются при длинном дне, мелатонин подавляет секрецию гонадотропинов и снижает уровень половой активности. У животных, размножающихся при коротком световом дне, мелатонин стимулирует половую активность. Влияние мелатонина на репродуктивную функцию у человека недостаточно изучено. В период полового созревания пиковая (ночная) концентрация мелатонина резко снижается. У женщин с гипофизарной аменореей концентрация мелатонина достоверно выше, чем у здоровых. Эти данные позволяют предполагать, что мелатонин подавляет репродуктивные функции у женщин.

Циркадный ритм и сон

Одним из основных действий мелатонина является регуляция сна. Мелатонин - основной компонент пейсмейкерной системы организма. Он принимает участие в создании циркадианного ритма: он непосредственно воздействует на клетки и изменяет уровень секреции другихгормонови биологически активных веществ, концентрация которых зависит от времени суток. Влияние светового цикла на ритм секреции мелатонина показано в наблюдении за слепыми. У большинства из них обнаружена ритмичная секреция гормона, но со свободно меняющимся периодом, отличающимся от суточного (25-часовой цикл по сравнению с 24-часовым суточным). То есть у человека ритм секреции мелатонина имеет вид циркадианной мелатониновой волны, «свободно бегущей» в отсутствие смены циклов свет-темнота. Сдвиг ритма секреции мелатонина происходит и при перелёте через часовые пояса.

Роль эпифиза и эпифизарного мелатонина в суточной и сезонной ритмике, режиме сна-бодрствования на сегодняшний день представляется несомненной. У диурнальных (дневных) животных (в том числе у человека) секреция мелатонина эпифизом совпадает с привычными часами сна. Проведенными исследованиями было доказано, что повышение уровня мелатонина не является обязательным сигналом к началу сна. У большинства испытуемых прием физиологических доз мелатонина вызывал лишь мягкий седативный эффект и снижал реактивность на обычные окружающие стимулы.

С возрастом активность эпифиза снижается, поэтому количество мелатонина уменьшается, сон становится поверхностным и беспокойным, возможна бессонница. Мелатонин способствует устранению бессонницы, предотвращает нарушение суточного режима организма ибиоритма.

Основное влияние мелатонина на эндокринную систему у многих видов заключается в торможении секреции гонадотропинов. Кроме того, снижается, но в меньшей степени, секреция других тропных гормонов передней долигипофиза-кортикотропина,тиротропина,соматотропина. Мелатонин снижает чувствительность клеток передней доли к гонадотропин-рилизинг фактору и может подавлять его секрецию.

Данные экспериментов свидетельствуют о том, что под влиянием мелатонина повышается содержание ГАМК- в ЦНС исеротонинавсреднем мозгеигипоталамусе. Известно, что ГАМК является тормозныммедиаторомв ЦНС, а снижение активности серотонинэргических механизмов может иметь значение впатогенезедепрессивных состояний.

Недостаток мелатонина в организме

Эксперименты на лабораторных животных показали, что при недостатке мелатонина, вызванном удалением рецепторов, животные начинали быстрее стареть: раньше начиналась менопауза, накапливались свободнорадикальные повреждения клеток, снижалась чувствительность кинсулину, развивалисьожирениеирак.

БИЛЕТ № 56

"

Здоровье

Концепция замены дефективных генов здоровыми, которая стала активно приобретать научную оболочку еще в начале девяностых годов прошлого века , казалось, подарит надежду самым безнадежным больным. Однако с момента первого эксперимента по генной терапии, осуществленном в 1990-ом году, оптимизма у ученых несколько поубавилось – и все из-за определенных неудач и трудностей в реализации методов генной терапии. Однако возможности, которые предлагает генная терапия для лечения болезни Паркинсона, кистозного фиброза, различных видов рака, и многих других заболеваний, поистине безграничны. Именно поэтому ученые трудятся не покладая рук , стараясь преодолеть все возникающие у них на пути трудности, связанные с генотерапией.

Что такое генотерапия?

Так чем же является генная терапия на самом деле? Для того, чтобы ответить на данный вопрос, необходимо напомнить, что основной функцией генов в нашем организме является регулирование производства белков , необходимых для нормальной работы и здоровья всех клеток. Но некоторые генетические дефекты (изъяны в генах) мешают выполнению их главной функции, в той или иной степени препятствуя выработке белков. Целью же генной терапии (генотерапии) является замена дефективных генов здоровыми . Это поможет наладить воспроизводство соответствующего белка, а значит, человек будет излечен от определенной болезни.

Если рассматривать идеальный сценарий развития, клетки с подкорректированными молекулами дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) начнут делиться, производя, в свою очередь, множественные копии исправленного гена, что позволит организму избавиться от генетической аномалии и полностью излечиться. Однако введение здоровых генов в больные клетки (как и попытки исправить соответствующие отклонения) является крайне сложным процессом, который пока крайне редко приводил к успеху . Именно поэтому большинство современных исследований направлено на разработку безопасных и надежных механизмов введения генов в поврежденные клетки.

Виды генной терапии: терапия ex vivo и in vivo

Генная терапия, в зависимости от способа введения ДНК в геном пациента, может осуществляться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo) . В случае с генной терапией ex vivo, клетки изымаются из организма пациента, генетически модифицируются, а затем вводятся обратно в организм индивидуума. Этот метод особенно полезен в лечении заболеваний крови, так как клетки крови можно довольно легко изъять и ввести обратно. Однако в случае с большинством других заболеваний, изъять клетки из организма и ввести обратно далеко не так просто. К примеру, в случае с заболеваниями сердца, обусловленными генетическими причинами , эффективным мероприятием является так называемая генная терапия in vivo, когда изменения генов осуществляются непосредственно в организме пациента. Для того чтобы проделать данную процедуру, генетическая информация доставляется непосредственно в клетку посредством вектора – молекулы нуклеиновой кислоты, используемой в генной инженерии для передачи генетического материала . В большинстве случаев, для того чтобы осуществить эту передачу, исследователи используют не опасные для здоровья и жизни вирусы.

Способы доставки в клетку генетической информации

Как показывают многочисленные исследования, использование различных вирусов является весьма эффективным решением, которое позволяет пробраться через имунную защиту организма , а затем инфицировать клетки, используя их для распространения вируса. Для осуществления данной процедуры, генные инженеры выбрали наиболее подходящие вирусы из группы ретровирусов и аденовирусов. Ретровирусы привносят генетическую информацию в виде рибонуклеиновой кислоты (РНК), молекулы, похожей на молекулу ДНК, которая помогает перерабатывать генетическую информацию, сохраненную в ДНК. Как только удается проникнуть вглубь так называемой клетки-мишени, из молекулы РНК получается копия молекулы ДНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией. Как только новая молекула ДНК оказывается присоединенной к клетке, все новые копии клеток будут содержать этот модифицированный ген.

Аденовирусы несут генетическую информацию сразу в виде ДНК, который доставляется в неделящуюся клетку. Хотя эти вирусы доставляют ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени , ДНК не совмещается с геномом клетки. Таким образом, модифицированный ген и генетическая информация не передаются дочерним клеткам. Преимуществом генной терапии, проводимой с помощью аденовирусов, заключается в том, что существует возможность введения генов в клетки нервной системы и в слизистую оболочку дыхательных путей, опять же, посредством вектора. Кроме того, существует и третий метод генной терапии, осуществляемый посредством так называемых аденоассоциированных вирусов. Эти вирусы содержат относительно небольшое количество генетической информации , и их гораздо сложнее вывести, чем ретровирусы и аденовирусы. Однако преимущество аденоассоциированных вирусов заключается в том, что они не вызывают реакции иммунной системы человека.

Сложности, при использовании вирусов в генной терапии

Главная проблема, которая связана со способом доставки генетической информации в клетку посредством вирусов, заключается в том, что полностью проконтролировать соединение генов с клеткой-мишенью чрезвычайно сложно . Это может быть крайне опасно, так как не исключена так называемая экспрессия генов, которая способна превратить здоровые клетки в раковые. На данный момент времени, эта проблема является особенно насущной в работе с ретровирусами. Вторая проблема, решение которой пока невозможно организовать , заключается в том, что одной процедуры применения генной терапии, чаще всего, бывает недостаточно. Большинство генетических терапий необходимо время от времени повторять. И, в третьих, использование вирусов для доставки генетической информации в клетку, осложняется риском возникновения реакции иммунной системы организма. Это также является крайне серьезной проблемой, особенно в тех случаях, когда требуется неоднократное повторение процедуры генной терапии , так как организм пациента постепенно адаптируется и начинает все эффективнее бороться с вводимыми вирусами.

Генная терапия: исследования продолжаются

Если говорить об успехах, то на данный момент времени генетическая терапия является крайне эффективным мероприятием в лечении так называемого комбинированного иммунодефицита , сцепленного с X-хромосомой ген. С другой стороны, случаев успешного использования генотерапии для лечения данной болезни крайне мало. Кроме того, само лечение представляет собой рискованное мероприятие, так как способно вызвать у пациентов ряд симптомов, которые встречаются у людей, страдающих от лейкемии. Помимо данного заболевания, случаев использования генной терапии, которые были бы так же эффективны, очень и очень мало, хотя последние исследования и дают надежду на скорое использование генотерапии для лечения больных, страдающих от артрита, рака мозга, серповидно-клеточной анемии, расщелины сетчатки и от некоторых других состояний.

Получается, что о практическом применении генной терапии в медицине говорить еще очень рано. Тем не менее, исследователи продолжают искать способы безопасного и эффективного использования генной терапии , проведя большую часть экспериментов в живой ткани, перенесенной из организма в искусственную внешнюю среду. Среди этих экспериментов крайне интересными представляются исследования, в рамках которых ученые пытаются ввести в клетку-мишень искусственную, 47-ю хромосому. Недавние научные изыскания позволили ученым лучше разобраться в процессах, происходящих при внедрении молекулы РНК . Это позволило разработать механизм подавления транскрипции гена (так называемое выключение гена), который, возможно, принесет пользу в лечении болезни Гамильтона. Ученые сообщают также о том, что им удалось разработать способ доставки генетической информации в клетки мозга, чего раньше нельзя было осуществить с помощью вектора, так как данная молекула была чересчур велика для этой цели . Иными словами, исследования продолжаются, а это значит, что у человечества есть все шансы научиться бороться с заболеваниями посредством использования методов генной терапии.