Какие типы ВПЧ существуют: особенности, симптомы и диагностика. Генетическое типирование опухоли Онкогенные ВПЧ и вызываемые ими болезни

Стоимость:

*без учета забора материалов

Срок выполнения (раб.дн.)

Время сдачи**

Весь день по графику работы медцентра

Методика

не обнаружено

Материал

урогенитальный соскоб

** График сдачи и условия подготовки актуальны только для данного анализа. Если необходимо сдать несколько анализов - рекомендуем уточнить график и условия по телефону колл-центра.

*** Обращаем ваше внимание, что сроки выполнения анализов могут быть увеличены по техническим причинам, связанным с особенностями биоматериала (гемолизированные, хилезные образцы, наличие сгустков и т.д.), что требует перестановок, а в некоторых случаях повторного забора материала.

Номенклатура

Human papillomavirus, HPV, вирус папилломы человека, ВПЧ

Описание

ВПЧ - наиболее часто встречающаяся инфекция, передаваемая половым путем. Преимущественно поражает эпителий, стимулирует его разрастание и приводит к образованию кондилом, бородавок, эрозиям. Известно более 100 типов вируса папилломы. Возможно носительство одновременно нескольких типов вируса у одного человека.

Некоторые типы вируса (онкогенные) при встраивании в геном клеток эпителия (интеграция) могут вызывать их злокачественное перерождение, приводя к раку. Самым опасным считается носительство ВПЧ 16 и 18 типов, поскольку оно с высокой долей вероятности приводит у женщин к развитию рака шейки матки.

Способ передачи

Контактный (при генитально-генитальных, генитально-оральных, генитально-анальных контактах), вертикальный (от матери ребенку), бытовой.

Инкубационный период

Составляет от нескольких недель до нескольких лет.

Особенности теста

Анализ инфекции с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет проводить чувствительное и специфичное определение наличия возбудителя, а также определяет его типы.

ДНК-ТИПИРОВАНИЕ (молекулярно-генетическая индивидуализация организмов, ДНК-индивидуализация), способ исследования генетического материала, направленный на выявление и оценку индивидуальных генетических особенностей биологического объекта. Цель такого исследования - установление сходства (или различий) разных организмов для определения степени их родства.

Метод ДНК-типирования основан на существовании различий в структуре ДНК у разных индивидуумов. Это касается так называемых гипервариабельных участков, обладающих структурным полиморфизмом (имеют несколько аллельных форм). В их формировании главную роль играют относительно короткие нуклеотидные последовательности, получившие название минисателлитные и микросателлитные ДНК, состоящие соответственно из 15-70 и 2-5 пар нуклеотидов. Эти последовательности рассеяны по геному в виде блоков (локусов) и имеют тандемную организацию (многократно следуют друг за другом). Число тандемных повторов (и, следовательно, длина самих локусов) варьирует в пределах от 2-4 до нескольких тысяч. Наличие повторяющихся элементов в таких гомологичных сателлитных блоках и обусловливает структурный полиморфизм этих локусов, проявляющийся, в частности, как феномен полиморфизма длины рестриктазных фрагментов (ПДРФ). Такие фрагменты образуются после ферментативного расщепления ДНК рестриктазами (внутри повторов расщепления не происходит из-за особенностей их нуклеотидного состава). В первоначальных вариантах ДНК-типирование фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в агарозном геле, а затем получали отпечаток этого геля на мембранном фильтре. Последний инкубировали в растворе, содержащем специально подобранные зонды - фрагменты ДНК, меченные радиоизотопом. Содержащие комплементарные зонду участки исследуемой ДНК связывались (гибридизовались) с ним и выявлялись с помощью радиоавтографии. Таким образом на радиочувствительной плёнке в виде набора полос идентифицировались сразу все микро- и минисателлиты геномной ДНК, гомологичные используемому зонду. По аналогии с анализом дактилоскопического оттиска (рисунком папиллярных линий) появился термин «генетическая, или геномная, дактилоскопия». Каждый индивидуум имеет свой геномный «отпечаток», который характеризуется определённым числом полос (до нескольких десятков), их расположением на дорожке и интенсивностью почернения каждой из полос. Чем больше родство, тем больше совпадений. Вся картина обнаруживает даже более высокую индивидуальную специфичность, чем папиллярные узоры, и поэтому может служить «генетическим удостоверением» личности. У кровных родственников число совпадающих полос заметно больше, у близнецов они идентичны.

Разработка метода (конец 1980-х годов) полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволила размножать (амплифицировать) любую последовательность ДНК, получать десятки и сотни миллионов её копий и использовать для молекулярно-генетического анализа исчезающе малые количества биологического материала. Появилась возможность сравнивать длину отдельных целых локусов минисателлитных ДНК, не подвергая их предварительному ферментативному расщеплению, т. е. осуществлять анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ). После разделения продуктов ПЦР электрофорезом их положение в геле выявляют с помощью специальных красителей, флуоресцентных меток и др. Разработаны также так называемые мультиплексные амплификационные системы, которые позволяют одновременно анализировать ПДАФ сразу нескольких локусов (их может быть более десяти). В этом случае амплификационный профиль ДНК, создаваемый уже суммой локусов, оказывается чрезвычайно полиморфным (является комбинацией нескольких независимых полиморфных элементов), но обеспечивает очень высокую достоверность анализа.

Вариабельность в структуре полиморфных генов мини- и микросателлитных ДНК может быть обусловлена также точечными нуклеотидными заменами. Такие локусы различаются только по нуклеотидному составу. В этом случае определяют первичную структуру амплифицированных фрагментов (смотри Секвенирование). Наиболее разработанным методом ДНК-типирования, основанным на секвенировании фрагментов, является анализ митохондриальной ДНК (мтДНК), которая характеризуется высоким уровнем полиморфизма, наличием большого числа копий, отсутствием рекомбинации и материнским характером наследования (зародыш получает митохондрии только из яйцеклетки). Всё это позволило широко использовать мтДНК в популяционных и филогенетических исследованиях, а в некоторых случаях сделало её единственно возможным инструментом для ДНК-типирования; например, когда ДНК, содержащаяся в образце, сильно деградирована, а хромосомная ДНК не может быть амплифицирована. Наследование по материнской линии и отсутствие рекомбинации позволяют использовать мтДНК в качестве так называемого «трассирующего» родословного генетического маркера. Это особенно важно при установлении родства в тех случаях, когда генетическая дистанция, разделяющая родственников, оказывается больше, чем одно поколение. Ярким примером использования мтДНК для ДНК-типирования явилась работа российских, британских и американских учёных по идентификации останков российской императорской семьи в 1992-98 годах. Позднее анализ мтДНК был многократно использован для индивидуализации костных и мумифицированных останков, возраст которых исчисляется десятками, сотнями и даже десятками тысяч лет.

Методом ДНК-типирования пользуются в криминалистике для идентификации личности и установления родственных отношений, а также в медико-биологическом анализе. В генетике и селекции сельскохозяйственных животных и растений этот метод используют для паспортизации и отбора чистопородного потомства животных, типирования сортов растений, определения межвидовых и межсортовых различий, а в практической бактериологии и эпидемиологии - для идентификации бактериальных штаммов. ДНК-типирование можно использовать при изучении структурно-функциональных особенностей генетического аппарата и явлений геномной нестабильности при нормальном функционировании клеток и патогенезе, в популяционной и эволюционной генетике.

Лит.: DNA Fingerprinting: State of the science. В. а. о., 1993; Иванов П. Л. Молекулярно-генетическая идентификация останков царской семьи // Вестник РАН. 1994. Т. 64. № 10; он же. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства // Судебно-медицинская экспертиза. 1999. № 4; он же. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе // Вестник РАН. 2003. Т. 73. № 12.

Или ДНК-типирование – это система идентификации, в основе которой лежит выявление генетических различий между индивидуумами или организмами. Каждое живое существо (за исключением однояйцовых близнецов) генетически уникально. Методики ДНК-типирования предназначены для выявления малейших генетических различий в последовательности чередования строительных блоков, из которых состоит ДНК. Эти блоки – нуклеотиды: аденин, тимин, цитозин и гуанин – обычно обозначаются как А, Т, С и G.

Иногда ДНК-типирование используется для сравнения нуклеотидных последовательностей ДНК двух индивидуумов с целью выявления их схожести. В других случаях ученые заинтересованы в выявлении схожести образца ДНК с заведомо известной последовательностью контрольного образца. На настоящий момент ДНК-типирование является одной из наиболее мощных и получивших широкое применение биотехнологических методик. Оно используется для выявления малейших различий в составе образцов ДНК, в том числе для определения совместимости донора и реципиента при проведении трансплантации органов и тканей, выявления специфических микроорганизмов, отслеживания необходимых генов в процессе селекции растений, установления отцовства, идентификации останков, регуляции размножения животных в условиях зоопарков.

Методы ДНК-типирования

Ученые разработали два подхода, позволяющие выявлять малейшие различия в генах. У каждого из методов есть свои достоинства и недостатки и оба они используются в фундаментальных и прикладных научных исследованиях, клинических центрах, судебной медицине и коммерческих лабораториях. Выбор метода зависит от решаемого вопроса, доступного количества ДНК, возможностей очистки образца, приемлемой стоимости и срочности. Иногда подходы комбинируются.

В одной из методик, получившей название рестрикционный анализ, используются естественные ферменты, разрезающие ДНК в строго фиксированных участках. Из-за различий в нуклеотидных последовательностях ферменты разрезают ДНК разных индивидуумов в разных местах. Получающиеся при этом отрезки ДНК имеют разные размеры и составляют ДНК-портрет или отпечаток, уникальный для каждого индивидуума. Сравнение наборов фрагментов ДНК предоставляет неоспоримое доказательство того, являются ли изучаемые образцы идентичными или нет.

Другой метод ДНК-типирования – полимеразная цепная реакция (ПЦР) – основан на использовании механизма, с помощью которого клетки осуществляют удвоение ДНК перед делением надвое. ПЦР обеспечивает получение тысяч копий специфических фрагментов ДНК в течение нескольких часов. Также как и рестрикционный анализ, ПЦР позволяет сравнивать образцы ДНК с целью выяснения их происхождения. Кроме того, с ее помощью можно выявлять наличие или отсутствие в образце специфичных фрагментов ДНК. Таким образом, ПЦР позволяет быстро и с высокой степенью точности диагностировать такие заболевания, как и , выявлять гены, определяющие предрасположенность индивидуума к различным формам рака и другим заболеваниям, а также обеспечить лучшую защиту индивидуума от ВИЧ/СПИД.

Для успешного выявления минимальных различий в структуре молекул ДНК ученые должны обращать внимание на регионы ДНК, отличающиеся высокой степенью вариабельности. Это является одной из причин того, что зачастую предпочтение отдается , а не . не только обладает большей степенью полиморфизма, чем ядерная, но и характеризуется уникальным методом наследования – практически вся достается организму от матери.

ДНК-типирование в судебной медицине

Во многих штатах внедрение ДНК-типирования в практику судебной медицины получило позитивный отклик, так как с его помощью была доказана причастность большого количества заключенных к преступлениям, в которых они обвинялись. Оно также обеспечило реабилитацию ряда несправедливо обвиненных граждан.

Повсеместное внедрение ДНК-типирования в судебную практику привело к изданию некоторыми штатами законов, требующих обязательного проведения ДНК-типирования преступников, обвиняемых в сексуальных и других правонарушениях для последующего занесения информации в базы данных штатов. Высшие правоохранительные органы надеются со временем объединить базы данных ФБР и отдельных штатов с целью создания единой национальной базы, которая позволила бы за минимальные промежутки времени сравнивать генетический материал с места преступления с данными об известных нарушителях.

ДНК-типирование используется также для идентификации останков людей, например для установления личностей неизвестных солдат или жертв катастроф. Сейчас все американские военнослужащие сдают образцы ДНК в банк данных, что обеспечивает достоверное установление личности даже в случае утери металлического солдатского жетона с регистрационным номером.

Установление отцовства

Установление отцовства с помощью ДНК-типирования возможно благодаря тому, что половину генетического материла ребенок получает от своего биологического отца. При необходимости с помощью рестрикционного анализа проводится сравнение ДНК-отпечатков матери, ребенка и предполагаемого отца. Сначала из теста изымаются фрагменты ДНК ребенка, аналогичные материнским. После этого оставшиеся фрагменты, унаследованные от биологического отца, сравниваются с фрагментами ДНК предполагаемого отца.

Антропология

С помощью ДНК-типирования ученые пытаются составить из тысяч фрагментов «Свитков Мертвого моря» целые документы. Для этого с помощью ДНК-типирования фрагменты, написанные на овечьей шкуре, отделяются от фрагментов, написанных на козьей шкуре, что существенно облегчает последующую реконструкцию целых свитков.

ДНК-типирование позволяет установить степень родства между ископаемыми человеческими костями, найденными в разных географических регионах и принадлежащими к разным геологическим эрам. Полученные при этом результаты проливают свет на историю человеческой эволюции.

С помощью ДНК-типирования ученые провели идентификацию останков царя Николая Романова II и его семьи, убитых большевиками в 1918 году. Для этого образцы ДНК, выделенные из найденных на месте захоронения костей, сравнивались с образцами ДНК живых потомков Николая II, в том числе принца Великобритании Филиппа. Полученные при этом результаты опровергли заявление женщины-самозванки, претендующей на имя якобы чудесным образом избежавшей уничтожения Великой княжны Анастасии Романовой.

Ресурсы живой природы

Чем больше мы понимаем систему организации генетического материала в природных популяциях, тем выше становится уровень осуществляемых нами проектов, направленных на сохранение и регулирование природного разнообразия. ДНК-типирование используется учеными для выявления количества генетических различий между популяциями одного и того же вида, изучения географического распределения видов, сохранения исчезающих и находящихся под угрозой исчезновения видов и определения степени генетической устойчивости диких популяций вымирающих видов. Например, на настоящий момент мы знаем, что гепарды находятся на грани исчезновения по большей части из-за сильного истощения генетического разнообразия.

Недавно ДНК-типирование помогло ученым разгадать загадку мексиканской популяции тихоокеанских морских черепах. Тихоокеанские морские черепахи размножаются в Японии и Австралии, однако очень молодые особи нередко встречаются около Мексиканского побережья. Биологи не могли предположить, что юные черепахи способны преодолеть вплавь 10000 миль, отделяющих Японию от Мексики и, тем более, еще большее расстояние от Австралии, поэтому происхождение мексиканских морских черепах до недавнего времени оставалось загадкой. Оказалось, что юных черепах из Японии и Австралии приносят к берегам Мексики океанские течения, а по достижении половой зрелости они отправляются в обратное плавание к местам своего размножения.

ДНК-типирование также используется для выявления нелегальной торговли продуктами, источниками которых являются животные находящихся под защитой видов. Например, японские специалисты установили факты продажи в стране нелегально ввезенного китового мяса и некоторых запрещенных к добыче морепродуктов. Подобные исследования образцов слоновой кости позволили выявить факты браконьерства в некоторых странах, где охота на слонов запрещена. И, наконец, в США ДНК-типирование используется для предотвращения ввоза в страну икры находящихся под угрозой вымирания осетровых.

Евгения Рябцева
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» http://www..org
Продолжение следует.

Сегодня изучено более ста разновидностей вируса ВПЧ, половина из них вызывает развитие образований на кожных покровах и слизистых оболочках интимных органов человека. Статистика говорит о том, что 80% населения Земли инфицировано. Это значит, что в клетках организма содержится ВПЧ разной степени онкогенности.

Наличие папилломавируса у пациента может привести к развитию серьезных осложнений, сложно предугадать, как поведет себя тот или иной тип возбудителя. Вот почему так важно знать особенности каждого генотипа, дабы эффективно вести борьбу с этой инфекцией.

Многие типы вируса папилломы человека являются совершенно безопасными для их носителя, возникают незначительные папилломы и бородавки, которые успешно устраняются косметологическими методами.

Другие типы папиллом относятся к онкогенной группе, провоцируют активное видоизменение клеток, что ведет к диагностированию рака у носителя. Разделение ВПЧ по типам позволяет разработать максимально правильную тактику лечения, на основе анализов на выявление микроорганизмов.

Человек может быть носителем нескольких ДНК ВПЧ, вирусы могут стабилизироваться, прекратить свое размножение или наоборот – процесс развития онкогенных клеток будет прогрессировать, а это значит, что остановить их негативное влияние на организм будет сложно.

Онкогенная группа

Генотипирование ВПЧ – важная процедура в диагностике выявления заболевания, это дополнительная возможность прогнозировать протекание нарушения. Всего в практической медицине подразделение папилломавируса происходит по трем группам.

1. Безопасные вирусы, не вызывают развитие рака, а значит, паниковать не стоит, главное, в дальнейшем не стать носителем других инфекций, регулярно сдавать анализы на обнаружение инфекции и не запускать состояние иммунной системы.
2. Низкая степень вероятности развития раковых клеток при выявлении папилломавируса 6,11,42- 44. В редких случаях может произойти мутации клеток, видоизменяясь в онкогенные.
3. Самая опасная группа, у женщин повышается риск развития ракового процесса, у мужчин – причина рака мочевого пузыря. Это ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 68.

Повышенное внимание к состоянию своего здоровья должны уделять пациенты с папилломавирусами 66 и 56, чаще всего такое носительство инфекции протекает бессимптомно, а потому выявить заболевание проблематично. Для каждого типа вируса важно проследить за признаками ВПЧ, провести специальное обследование и при необходимости начать квалифицированное лечение.

Особенности каждого типа вируса

Классификация вирусов помогает определить степень сложности заболевания, которое может спровоцировать такая инфекция. Обычные бородавки вызываются вирусом 2 типа, передается бытовым путем, при контакте с носителем, чаще всего страдают дети и подростки.

Защитные силы организма позволяют справиться иммунной системе с инфекцией, образования исчезают бесследно, главное не травмировать кожу в месте развития папиллом, дабы не вызвать вторичное заражение.

При инфицировании ВПЧ 3 и 5 появляются небольшие наросты на лице и ладонях. Такие высыпания еще называют юношескими, а значит, организм может самостоятельно справиться с этой инфекцией без медикаментозного вмешательства.

При обнаружении подошвенных бородавок можно уверенно говорить про наличие в организме папилломавируса 1 и 2 типов. Чаще всего страдают женщины, из-за ношения узкой обуви на высоком каблуке. Кожа на бородавке со временем утолщается, наросты размножаются по телу.

Образования ВПЧ 1 типа прорастают внутрь, доставляют дискомфорт при ходьбе, ноют и болят, особенно ночное время. Папилломавирус второго генотипа проявляется мозаичными наростами, которые не вызывают болевых ощущений, только эстетический дискомфорт.

Остроконечные кондиломы у женщин располагаются на слизистых оболочках половых органах и гениталиях, а у мужчин – на головке пениса и крайней плоти. Это опасные вирусы 6 и 11 типа.

Если обнаружен папилломавирус с малым онкогенным риском, это значит, что речь идет о присоединении инфекции 20, 21, 14, 25, 27 типа. Чаще всего это доброкачественные образования, не имеющие рецидивного характера.

Во время родовой деятельности матери ребенок может заразиться ларингеальным папилломатозом, ВПЧ типа 11. Такая форма заболевания наблюдается у детей до пяти лет, при обильном обнаружении образований может возникнуть риск удушья.

Определение опасности 16 и 18 типа ВПЧ

С помощью анализа гемотест можно сделать наиболее точный прогноз протекания болезни, значит выявить сразу несколько генотипов вируса, поставить правильный диагноз и начать своевременное лечение.

Если обнаружено сочетание 16 и 18 типов, то это будет свидетельствовать о наличии высокой степени онкогенности - потребуется кольпоскопическое обследование.

Благодаря гемотесту ВПЧ можно исключить возможность рецидива с летальным исходом.

При диагностировании женщин с раком шейки матки можно точно сказать, что причиной мутации является вирус 16 типа. Под воздействие благоприятных факторов (ослаблению иммунной системы, наличия других инфекций половых органов) папилломавирус начинает свое губительное воздействие на клетки, меняя их ДНК.

Это значит, что вирус генотипа 16 влияет на развитие предракового состояния, вызывает дисплазию шейки матки, обильно формируются папилломы и кондиломы по всему телу пациентки. У мужчин эти опасные штаммы вируса способны вызывать болезнь Боуэна, повреждение слизистой оболочки полового органа.

Благодаря высокоразрешающему анализу на ДНК ВПЧ (27 типов) можно выявить опасные патологические видоизменения в организме, вызваны наличием различных типов вируса папилломы.

При дисплазии шейки матки помимо 16 и 18 вируса еще встречаются 32, 30, 57, 61 и другие онкогенные типы. Если во время обследования анализы подтвердили наличие только одного типа ВПЧ высокого риска, а наростов при этом нет, это значит, что можно говорить о самоудалении инфекции из организма.

Другие типы накожных наростов

ВПЧ 49 штамма проявляется разрастаниями одиночных плоских образований, которые можно легко удалить с помощью лазерного аппарата. Этот генотип не является онкогенным, вторично не возникает.

Обнаружение вируса 57 штамма у женщины свидетельствует о предраковом состоянии пациентки, если имеются наросты на лице, то они удаляются с помощью импульсного потока, после чего не остается следов и рубцовой ткани.

Наросты ВПЧ 27 типа у мужчин и женщин можно убрать жидким азотом, появление вторичной инфекции исключено. Штаммы с номерами 51, 52, 56 являются онкогенными, а это значит, что дальнейшие изменения в структуре ДНК может стать причиной появления рака.

У мужчин развитие онкологии полового органа и анального отверстия. Только своевременная медикаментозная терапия может замедлить эти процессы и оставить губительное деление клеток ДНК.

ВПЧ 37 типа выступает одной из причин развития кератоакантомы, что свидетельствует о возникновении доброкачественной опухоли на коже, места локализации – лицо, открытые участки тела, в исключительных случаях – закрытые зоны.

Анализы на выявление ВПЧ 38 типа могут свидетельствовать о развитии меланомы, это злокачественные наросты, которые отличаются агрессивностью и стремительным фактором развития, а это значит, что игнорировать симптоматику нельзя, так как заболевание может оказать негативное влияние на все органы и системы человека.

Анализ на ВПЧ разновидности

Существует несколько лабораторных методик, которые с точностью смогут определить, сколько штаммов вируса присутствуют в организме мужчины и женщины. Для этого применяются такие виды диагностики как полимерная цепная реакция, анализ генотипирования. ПЦР проводится для определения типа вируса, а результаты этого исследования имеют вид таблицы со списком видов ВПЧ, пометками обнаруженных из них и указанием вирусной нагрузки.

Материал для анализа у женщин – мазок из цервикального канала. При беременности анализ на папиллому проводить необязательно, потому что нет угрозы для матери и плода. Мужчинам при подозрительных образованиях нужно обратиться к урологу. Только такое особое внимание к своему здоровью поможет избежать серьезных последствий для женщин после инфицирования организма.

Когда нужно делать диагностику ВПЧ женщинам?

Не стоит допускать ярко выраженные симптомы заболевания, важно регулярно проходить профилактический осмотр у гинеколога один-два раза в год, обязательно сдавать анализы на выявление инфекции после первого года половой жизни.

Заключение

Все классификации выявления ВПЧ в организме претерпевают изменения, ведь вирусы мутируют, вызывают осложнения, не поддаются лечению, повторно возникают после удаления, усложняется процесс диагностирования и расшифровки анализов.

Специфика подобных новообразований еще до сих пор точно не изучена, сколько еще времени потребуется, чтобы снизить риск опасности после заражения онкогенными штаммами и полностью удалить вирус из организма неизвестно.

Для пациентов с любым типом ВПЧ требуется индивидуальный терапевтический подход, чтобы успешно приостановить распространение вируса в организме нужно регулярно обследоваться у профильных специалистов, соблюдать указанные рекомендации, вести здоровый образ жизни.

Главная опасность ВПЧ для женщин и мужчин – это образование злокачественной опухоли, потому такая классификация вируса производится с учетом степени его онкологической опасности.

Берегите себя и будьте здоровы!

Результаты, полученные при исследовании структуры и организации геномной ДНК животных, растений и микроорганизмов, наложили глубокий отпечаток на методологию их систематизации. Проблема адекватного отнесения конкретного организма к той или иной группе не является чисто академической. Основанная на точных критериях систематика живых организмов, определяющая эволюционное родство между ними, помимо чисто теоретического представляет и большой практический интерес. В частности, знание источника различных штаммов патогенных микроорганизмов, вызывающих больничные инфекции, позволило бы выработать эффективные меры защиты против их распространения.

Недавно были обнаружены генетические маркеры в виде специфических последовательностей ДНК, которые дают возможность выявлять родственные отношения между особями одного и того же вида путем внутри- и межпопуляционных исследований. Такого рода исследования популяций человека особенно важны с практической точки зрения. В настоящее время молекулярно-генетические методы позволяют осуществлять идентификацию личности в судебно-медицинских исследованиях, а также решать в спорных случаях проблему определения отцовства.

Генетическим, или ДНК-типированием, называют определение особенностей генотипа организма путем анализа ДНК его генома. Иными словами, в процессе ДНК-типирования определяют особенности первичной структуры ДНК исследуемого организма в конкретных генетических локусах. Абсолютно консервативных генетических локусов, по-видимому, не существует. Мутационные изменения генома непрерывно накапливаются на протяжении филогенетического (исторического, эволюционного) развития вида. Но такого же рода изменения неуклонно происходят в геномах отдельных особей, принадлежащих одной или разным популяциям. Естественно, что проще всего обнаруживаются межвидовые различия в последовательностях нуклеотидов исследуемых участков генома, поскольку эти различия, как правило, значительны, и именно они определяют эволюционное расстояние между видами (их дивергированность ).

Таким образом, у каждого вида организмов имеется большое число внутривидовых различий в первичной структуре ДНК отдельных генетических локусов. Генетические локусы, выполняющие одну и ту же функцию (содержащие один и тот же ген или несколько генов), но различающиеся по первичной структуре ДНК, называют полиморфными , а само явление существования в популяции полиморфных локусов получило название генетического полиморфизма .

1. Днк-типирование микроорганизмов

Наиболее часто в настоящее время используют два способа ДНК-типирования патогенных микроорганизмов, в основе которых лежит метод ПЦР. В первом случае используют один или несколько коротких праймеров произвольной первичной структуры длиной в 6–15 нуклеотидов, которые из-за своих малых размеров обладают низкой специфичностью в отношении конкретных генетических локусов и способны гибридизоваться со многими сайтами геномной ДНК. Во втором случае применяют специфические олигонуклеотидные праймеры длиной в 20–27 нуклеотидов, последовательности которых фланкируют исследуемую последовательность нуклеотидов в бактериальном геноме.

Рис. II.35. Схема ДНК-типирования микроорганизмов с использованием ПЦР и праймеров произвольной структуры

а – штаммоспецифические различия, обусловленные разной локализацией участков ДНК, взаимодействующих с праймерами. В ДНК штаммов 2 и 3 отсутствует участок, который имеется в ДНК штамма 1, что приводит к исчезновению соответствующей полосы продукта ПЦР на электрофореграмме;б – результаты амплификации ДНК, содержащей сайты связывания праймеров постоянной локализации. ДНК штаммов 2 и 3 содержат делеции разной длины между сайтами связывания праймеров. Альтернативно, ДНК штаммов 1 и 2 могут содержать вставки, отсутствующие у ДНК штамма 3. Это находит отражение в длинах продуктов ПЦР, разделяемых электрофорезом. А, Б – сайты связывания праймеров на ДНК

Генетическое типирование микроорганизмов с использованием праймеров произвольной первичной структуры. Использование коротких олигонуклеотидных праймеров произвольной структуры основано на том, что в больших геномах для них имеются множественные сайты посадки, а следовательно, и инициации ПЦР. Чем короче такие праймеры, тем большее количество сайтов посадки для них должно существовать. Одним из ограничений дальнейшего участия таких праймеров в ПЦР будет расстояние между двумя сайтами посадки для противоположно направленных праймеров. Чем длиннее ПЦР-продукт, который должен образовываться в результате функционирования таких праймеров, тем менее надежно работает вся система типирования. На практике длина образующихся с произвольными праймерами продуктов ПЦР находится в пределах 0,2–2,0 т.п.о.

В зависимости от локализации на ДНК мест посадки для пары коротких праймеров могут образовываться два типа продуктов ПЦР. В первом случае различия в длинах продуктов ПЦР обусловлены присутствием на ДНК типируемых микроорганизмов разного числа сайтов связывания для одного или обоих праймеров (рис. II.35,а ). Во втором случае такие различия определяются длинами сегментов ДНК (ампликонов ), заключенных между парами мест посадки праймеров при неизменном их числе в конкретных генетических локусах (см. рис. II.35,б ). На практике могут одновременно реализовываться обе эти возможности. Во время генетического типирования эукариот указанными методами иногда сразу функционируют до 100 ампликонов, тогда как у бактерий это число достигает лишь 20.

Несмотря на то что при обсуждаемом подходе последовательности праймеров выбираются произвольно, получаемая картина амплификации, как правило, является видо- и штаммоспецифичной. При этом количество сайтов связывания на одной и той же ДНК для праймеров одинаковой длины, но с разной первичной структурой может существенно варьировать. На рис. II.35 показаны такие свойства двадцати 10-нуклеотидных праймеров, испытанных на ДНК человека, бобов и S. aureus. Видно, что использование праймера AGGGGTCTTG, например, приводит к амплификации 8 ампликонов в ДНК человека, 3 ампликонов в ДНК соевых бобов и не выявляет ни одного ампликона в ДНК S. aureus, тогда как при использовании праймера AATCGGGCTG удается обнаруживать до 40 ампликонов в ДНК человека и соевых бобов и до 20 ампликонов в бактериальной ДНК. Таким образом, при использовании обсуждаемого метода в ДНК-типировании самым важным этапом является подбор праймеров или их комбинаций для наиболее эффективного определения принадлежности организма к тому или иному виду, штамму или линии.

Генетическое типирование микроорганизмов с использованием геномных фингерпринтов. При другом подходе к генетическому типированию с использованием ПЦР исследуют полиморфизм конкретных локусов, для которых хотя бы частично известна первичная структура. Синтезируют специфические олигонуклеотидные праймеры, сайты связывания которых фланкируют исследуемую последовательность ДНК с длиной 1,5–2,5 т.п.о. После проведения ПЦР особенности первичной структуры продуктов ПЦР определяют с помощью рестрикционного анализа. Положение сайтов рестрикции в анализируемой последовательности нуклеотидов может иметь видо- или штаммоспецифический характер и служить точным генетическим маркером того или иного микроорганизма.

С помощью этого метода, который по своей сути является разновидностью рассмотренного выше способа определения ПДРФ, идентифицируют близкородственные, сходные по фенотипу штаммы возбудителей заболеваний, исследуют генетическую структуру популяций микроорганизмов и механизмы их адаптивной изменчивости.