Способы введения рекомбинантных днк в клетки бактерий. Доставка генов в клетку. Иммуностимулирующее действие бактериальных CpG динуклеотидов

Методика, разработанная учеными из Калифорнийского Университета в Ирвине (University of California, Irvine) под руководством доктора Питера Донована (Peter Donovan) и основанная на комбинации двух известных способов манипулирования с эмбриональными стволовыми клетками, позволяет вдвое увеличить эффективность доставки ДНК в человеческие эмбриональные стволовые клетки.

Современные методы введения ДНК в чЭСК с помощью химической трансфекции, нуклеофекции и электропорации обладают серьезным недостатком – низкой эффективность. Доставка в чЭСК генетического материала с помощью вирусной инфекции более результативна, но имеет много нежелательных последствий для стволовых клеток и не может быть названа полностью безопасной с медицинской точки зрения, если клетки предназначены для дальнейшей трансплантации.

Новая методика, основанная на комбинации нуклеофекции отдельной стволовой клетки и оптимизированного метода селекции полученных трансгенных колоний, обеспечивает своевременную и стабильную экспрессию трансгенов в клетках. Нуклеофекция заключается в образовании пор в клеточной мембране с помощью электрических импульсов и последующего внедрения в клетку ДНК.

Кроме интересующего гена, модифицирующая ДНК-конструкция несет ген, позволяющий легко отслеживать трансформированную клетку, - например, ген, кодирующий зеленый флюоресцирующий белок (humanized Renilla green fluorescent protein, hrGFP). Такой способ маркировки клеток дает возможность наблюдать за перемещением трансформированных клеток при их трансплантации животным.

Потенциально этот метод мог бы оказаться полезным для терапии моногенных заболеваний, вызванных мутациями одного гена во всех клетках больного человека. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, более 10 000 болезней человека имеют моногенную природу. Миллионы людей во всем мире страдают моногенными заболеваниями, к которым относится болезнь Хантингтона, серповидноклеточная анемия, гемофилия и муковисцидоз.

Новый метод расширит возможности манипулирования чЭС клетками, позволит моделировать болезни человека и находить подходящие лекарства. С помощью этой методики ученые смогут корректировать генетические нарушения в стволовых клетках и использовать здоровые клетки в регенеративной медицине.

Колония чЭС клеток, экспрессирующая зеленые флюоресцирующие белки hrGFP .

Статья Hohenstein KA et al. «Nucleofection Mediates High-efficiency Stable Gene Knockdown and Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells» доступна в on-line версии журнала Stem Cells с 6 марта 2008.

Как показывают многочисленные исследования, использование различных вирусов является весьма эффективным решением, которое позволяет пробраться через имунную защиту организма , а затем инфицировать клетки, используя их для распространения вируса. Для осуществления данной процедуры, генные инженеры выбрали наиболее подходящие вирусы из группы ретровирусов и аденовирусов. Ретровирусы привносят генетическую информацию в виде рибонуклеиновой кислоты (РНК), молекулы, похожей на молекулу ДНК, которая помогает перерабатывать генетическую информацию, сохраненную в ДНК. Как только удается проникнуть вглубь так называемой клетки-мишени, из молекулы РНК получается копия молекулы ДНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией. Как только новая молекула ДНК оказывается присоединенной к клетке, все новые копии клеток будут содержать этот модифицированный ген.

Аденовирусы несут генетическую информацию сразу в виде ДНК, который доставляется в неделящуюся клетку. Хотя эти вирусы доставляют ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени , ДНК не совмещается с геномом клетки. Таким образом, модифицированный ген и генетическая информация не передаются дочерним клеткам. Преимуществом генной терапии, проводимой с помощью аденовирусов, заключается в том, что существует возможность введения генов в клетки нервной системы и в слизистую оболочку дыхательных путей, опять же, посредством вектора. Кроме того, существует и третий метод генной терапии, осуществляемый посредством так называемых аденоассоциированных вирусов. Эти вирусы содержат относительно небольшое количество генетической информации , и их гораздо сложнее вывести, чем ретровирусы и аденовирусы. Однако преимущество аденоассоциированных вирусов заключается в том, что они не вызывают реакции иммунной системы человека.

Генеалогический метод антропогенетики

В основе этого метода лежит составление и анализ родословных. Этот метод широко применяют с древних времен и до наших дней в коневодстве, селекции ценных линий крупного рогатого скота и свиней, при получении чистопородных собак, а также при выведении новых пород пушных животных.

Как метод изучения генетики человека генеалогический метод стали применять только с начала XX столетия, когда выяснилось, что анализ родословных, в которых прослеживается передача из поколения в поколение какого-то признака (заболевания), может заменить собой фактически неприменимый в отношении человека гибридологический метод.

При составлении родословных исходным является человек - пробанд, родословную которого изучают. Обычно это или больной, или носитель определенного признака, наследование которого необходимо изучить. При составлении родословных таблиц используют условные обозначения, предложенные Г. Юстом в 1931 г. (рис. 6.24). Поколения обозначают римскими цифрами, индивидов в данном поколении - арабскими.

С помощью генеалогического метода может быть установлена наследственная обусловленность изучаемого признака, а также тип его наследования (аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный, X-сцепленный доминантный или рецессивный, Y-сцепленный). При анализе родословных по нескольким признакам может быть выявлен сцепленный характер их наследования, что используют при составлении хромосомных карт. Этот метод позволяет изучать интенсивность мутационного процесса, оценить экспрессивность и пенетрантность аллеля. Он широко используется в медико-генетическом консультировании для прогнозирования потомства. Однако необходимо отметить, что генеалогический анализ существенно осложняется при малодетности семей.

Все методы получения ГМО делят на прямые (безвекторные) и непрямые (векторные).

Все прямые способы получения трансгенных животных имеют ряд существенных недостатков : трудоемкость, использование дорогостоящего оборудования и реактивов, зачастую случайная встройка молекул ДНК в геном клеток трансформируемых животных, большое количество гибнущих после трансформации клеток, мозаичность по введенному трансгену.

Значительным преимуществом использования прямых методов является довольно высокая эффективность переноса чужеродной ДНК, то есть удается перенести трансген в большее, чем при непрямых методах, количество клеток.

Требования к векторной ДНК, ее состав

Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена . Задача вектора - донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент, встроить ее в геном, позволить идентификацию трансформированных клеток, обеспечить стабильную экспрессию введенного гена.

Таким образом, вектор должен быть небольшим, способным поддерживаться в клетке-хозяине (реплицироваться), многократно копироваться (ампфлицироваться), экспрессировать соответствующий ген (содержать соответствующие регуляторные последовательности), должен иметь маркерный ген, позволяющий различать гибридные клетки для эффективной селекции их; должен быть способен передаваться в клетку соответствующего организма.

Вместе с геном интереса в клетку-реципиент вводят маркерные гены , необходимые для определения трансгенности организма.

Можно выделить 2 группы маркерных генов, позволяющие отличить трансформированные клетки:

• 1. Селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам (канамицину, тетрациклину, неомицину и др.), гербицидам (у растений). Это могут быть гены ауксотрофности по какому-либо субстрату и т.д. Основной принцип работы такого маркера - способность трансформированных клеток расти на селективной питательной среде, с добавкой определенных веществ, ингибирующих рост и деление нетрансформированных, нормальных клеток.
• 2. Репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано.

Чаще всего в качестве репортерных используются гены в-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). К настоящему времени из этого арсенала наиболее часто используют гены GUS и GFP и, в меньшей степени, LUC и CAT. Используемый в настоящее время как репортерный ген GUS является модифицированным геном из Escherichia coli, кодирующим в-глюкуронидазу с молекулярной массой 68 кД. GUS активен в широком диапазоне условий среды с оптимумом при рН 5-8 и 37°С. Он может гидролизовать обширный спектр природных и синтетических глюкуронидов, что позволяет подбирать соответствующие субстраты для спектрофотометрического или флюориметрического определения активности фермента, а также для гистохимического окрашивания тканей in situ (например, в синий цвет). Фермент достаточно стабилен: он устойчив к нагреванию (время полужизни при 55°С составляет около 2 ч) и к действию детергентов. В процессе замораживания-оттаивания потери активности GUS не происходит. В составе химерных белков, созданных генно-инженерными методами, GUS обычно сохраняет свою функциональную активность. В живых клетках белок GUS также весьма стабилен и активен от нескольких часов до нескольких суток.

GFP (green fluorescent protein - зеленый флюоресцентный белок, или белок зеленой флюоресценции) был обнаружен Shimomura с соавт. в 1962 г. у люминесцирующей медузы Aequorea victoria. Ген GFP был клонирован в 1992 г. Prasher и соавт., и уже через несколько лет началось активное использование этого гена как репортерного в работах с самыми разными про- и эукариотическими организмами. В настоящее время ген GFP применяется в сотнях работ во всем мире, и число их стремительно нарастает. Столь быстрый рост вызван особыми свойствами белка GFP, а именно его способностью флюоресцировать в видимой (зеленой) области спектра при облучении длинноволновым УФ. Эта флюоресценция обусловлена непосредственно белком, для ее проявления не требуется субстратов или кофакторов. Благодаря этому свойству ген GFP является очень перспективным репортерным геном, позволяющим проводить разнообразные прижизненные (недеструктивные) исследования с трансгенными организмами.

Из морской анемоны Discosoma sp. недавно выделен еще один белок DsRed, флуоресцирующий в красном свете. Еще несколько аналогичных флюоресцирующих белков было выделено в самое последнее время учеными Российской академии наук из различных коралловых полипов порядка Anthozoa. Он может быть денатурирован очень высокой температурой, крайними значениями рН или сильными восстановителями типа Na2SO4. При возвращении к физиологическим условиям GFP в значительной степени восстанавливает способность к флюоресценции. В составе химерных белков, созданных генноинженерными методами, GFP обычно сохраняет свою функциональную активность. В живых клетках белок GFP также очень стабилен.

CAT - гены отвечают за синтез хлорамфениколацетилтрансферазы (выделены из Escherihia coli). Этот фермент катализирует реакцию переноса ацетильной группы от ацетил-КоА к хлорамфениколу. Определяется гистохимически, по изменению окраски ткани при добавлении соответствующего субстрата.

Рекомбинантные ДНК вводятся в клетки – реципиенты. В генной инженерии такие реципиентные клетки играют 2 роли. 1. Они позволяют отыскивать в банке генов клоны синтезируемой рекомбинантной ДНК. 2 Впоследствии такие реципиентные клетки могут использоваться для получения целевых продуктов.

Способ введения рекомбинантной ДНК учитывается на основе вектора какого типа была получена такая рекомбинантная ДНК и в клетки каких организмов необходимо ее ввести путем трансформации клетки или протопласта, или с использованием метода электропорации. Если рекомбинантную ДНК получать на основании фагов, ее можно вводить в изолированную ДНК – это трансвекция. Можно вводить интактные фаговые частицы – это инфекция (космиды, фазмиды).

Др. способы генетического обмена – конъюгация, трансдукция.

В клетках растений – трансформация растительных протопластов, обработка растительных клеток или тканей рекомбинантыми ДНК; широко используются инъекции рекомбинантных ДНК в ядро; использование липосом. Липосомы – сферические структуры, которые имеют липидную оболочку, внутри которой находится рекомбинантная ДНК. Для введения в клетки животных – вирусные инфекции, метод электропорации, микроинъекции в ядро. Если после введения рекомбинантной ДНК все клетки в организме ее наследуют, то говорят о получении трансгенного организма.

Электропорация – клетки или протопласт в течение короткого промежутка времени подвергаются воздействию тока высокого напряжения (2000-4000 вольт). В результате в мембране клетки образуются поры ок. 30 нм, которые могут существовать 1-2 минуты и ч/з которые в клетку могут поступать рекомбинантные ДНК. Затем поры закрываются, а ДНК остается в клетке. Это универсальный способ.

Баллистический метод – применятся преимущественно у эукариот. Используются баллистические пушки в которые вносятся частицы АК или W, на которые напыляются рекомбинантная ДНК. Затем, с помощью инертных газов при Р, такие частицы выстреливаются из пушки в культуру клеток. По различным закономерностям часть частиц попадает в ядро и рекомбинантные ДНК там задерживаются.

Поиск клонов с рекомбинантной ДНК.

Этот этап сложен и непредсказуем.

Самый простой метод – это поиск клонов по фенотипу после введения рекомбинантной ДНК (например пигментация). Можно воспользоваться комплементационными тестами, но необходимо иметь мутантные клетки, дефективные по синтезу активного продукта.

Методы гибридизационные – необходимо наличие специфических меченых ДНК или РНК зондов. Чаще их метят Р 32 . Зондами м. б. короткие олигонуклеотидные последовательности, которые соответствуют наиболее консервативной части отыскиваемого гена. Эти консервативные последовательности могут включать до 100 нуклеотидов для прокариот и до 1000 для эукариот.

После введения рекомбинантной ДНК, формирующиеся на среде колонии, переносятся на специальный нитроцеллюлозный фильтр. Их подвергают лизису и последующей денатурации ДНК с использованием щелочи. ДНК прочно связывается с фильтром. Фильтр промывается и обрабатывается радиоактивным меченым зондом и определяют тот клон с которым этот зонд связался.

Иммунохимические методы – клоны после введения рекомбинантной ДНК лизируют и обрабатывают антителами к соответствующему продукту. Такие антитела – меченые.