Reazioni immunologiche per identificare antigeni specifici. Reazione immunitaria I. Reazione di agglutinazione

I due principali tipi di risposte immunitarie sono reazione innata E reazione adattativa (acquisita).Reazione innata, che avviene con l'ausilio di neutrofili, macrofagi, mastociti e cellule natural killer, si sviluppa rapidamente, è aspecifico ed è più antico dal punto di vista evolutivo. Non è associato alla formazione delle cellule della memoria. Acquisito adattivo la risposta, che dipende dal riconoscimento iniziale degli antigeni da parte delle cellule B e T, è molto più complessa, avviene più lentamente, è specifica, è accompagnata dalla formazione di cellule di memoria, ed è considerata un'acquisizione evolutiva più recente.

La risposta immunitaria si verifica come risultato dell'interazione dei linfociti T e B, delle cellule presentanti l'antigene e delle citochine. Comprende 4 fasi: riconoscimento dell'antigene, attivazione, proliferazione e differenziazione cellulare.

I meccanismi adattativi che portano all'eliminazione degli antigeni sono suddivisi in umorale E immunità cellulare. Immunità umoraleè fornita da anticorpi prodotti da plasmacellule derivate da cloni di linfociti B attivati.

Risposta immunitaria cellulare si forma durante il trapianto di organi e tessuti, l'infezione da virus e la crescita di tumori maligni. L'immunità cellulare si manifesta in due tipi principali di reazioni: citotossicità e ipersensibilità di tipo ritardato (DTH). L'immunità cellulare coinvolge una cellula citotossica (Tc), che reagisce con un antigene in complesso con le proteine ​​MHC di classe I nella membrana plasmatica della cellula bersaglio.

Reazioni citotossiche procedere come segue: una cellula T citotossica uccide una cellula infettata da un virus se riconosce, utilizzando i suoi recettori, frammenti di proteine ​​virali associate a molecole MHC di classe I sulla superficie della cellula bersaglio infetta. Il legame di una cellula citotossica alle cellule bersaglio porta al loro rilascio di proteine ​​​​che formano i pori chiamate perforine, che polimerizzano nella membrana plasmatica della cellula bersaglio in presenza di Ca 2+, trasformandosi in canali transmembrana (pori). Attraverso questi pori, altre proteine ​​secrete da Tc entrano nella cellula bersaglio. granzimi. Questi, a loro volta, attivano gli enzimi intracellulari caspasi. Questi ultimi includono segnali per lo sviluppo dell'apoptosi. La stessa cellula T killer è protetta dagli effetti citotossici della perforina. Il meccanismo di autodifesa è sconosciuto.

Reazioni di ipersensibilità ritardate(HRT). Macrofagi e Tx prendono parte a queste reazioni. Queste reazioni si sviluppano diversi giorni dopo l'esposizione all'antigene: la compattazione e l'infiammazione del tessuto si verificano a causa della sua infiltrazione da parte di linfociti T e macrofagi. La TOS è causata dalle cellule T helper (CD4+), che secernono citochine (IFN-γ) che attivano i macrofagi e inducono l'infiammazione (TNF - fattore di necrosi tumorale).

Nella terapia ormonale sostitutiva, il danno tissutale si verifica a causa dei prodotti dei macrofagi attivati, come enzimi idrolitici, intermedi dell'ossigeno e citochine. Nella TOS cronica, la fibrosi si sviluppa spesso come risultato della secrezione di citochine e fattori di crescita dei macrofagi.

Farmaci e cosmetici possono combinarsi con le proteine ​​dei tessuti, formando un antigene complesso, con lo sviluppo della TOS da contatto. Le malattie infettive (brucellosi, tularemia, tubercolosi, lebbra, toxoplasmosi, molte micosi, ecc.) Sono accompagnate dallo sviluppo della terapia ormonale sostitutiva, pertanto, per la diagnosi, vengono utilizzati test allergici cutanei con allergeni patogeni (ad esempio, la reazione di Mantoux).

Risposta immunitaria umorale (produzione di anticorpi) si sviluppa nel corpo in risposta agli antigeni localizzati extracellularmente. Coinvolge i macrofagi (cellule che presentano l'antigene), i linfociti Tx e B. Questa risposta è la seguente.

L'antigene che entra nel corpo viene assorbito dal macrofago. Il macrofago lo scompone in frammenti che, in combinazione con le molecole MHC di classe II, compaiono sulla superficie cellulare. Questa elaborazione dell'antigene da parte di un macrofago viene chiamata in lavorazione antigene.

Per l'ulteriore sviluppo della risposta immunitaria all'antigene è necessaria la partecipazione delle cellule Tx (helper). Ma prima, i Tx devono essere attivati ​​da soli. Il “riconoscimento” da parte delle cellule Tx del complesso “antigene + molecola MHC di classe II” sulla superficie del macrofago stimola la secrezione di interleuchina-1 (IL-1) da parte del macrofago. Sotto l'influenza di IL-1, viene attivata la sintesi e la secrezione di IL-2 da parte delle cellule Th. Il rilascio di IL-2 da parte delle cellule Tx stimola la proliferazione delle cellule Tx (helper). Un tale processo può essere considerato una stimolazione autocrina, poiché la cellula risponde all'agente che essa stessa sintetizza e secerne. Un aumento dell'abbondanza di Th è necessario per l'implementazione di una risposta immunitaria ottimale.

Tx attiva le cellule B secernendo IL-2. L'attivazione del linfocita B avviene anche attraverso l'interazione diretta dell'antigene con il recettore immunoglobulinico della cellula B. Il linfocita B stesso elabora l'antigene e presenta il suo frammento in complesso con una molecola MHC di classe II sulla superficie cellulare. Questo complesso riconosce Tx già coinvolto nella reazione immunitaria (Figura 11). Il riconoscimento da parte del recettore delle cellule Tx del complesso "molecola MHC AG + classe II" sulla superficie del linfocita B porta alla secrezione di interleuchine da parte delle cellule Tx - IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 , γ-IFN (γ-interferone ), sotto l'influenza del quale la cellula B si moltiplica e si differenzia con la formazione di plasmacellule e cellule B di memoria. Pertanto, IL-4 avvia l'attivazione delle cellule B, IL-5 stimola la proliferazione delle cellule B attivate e IL-6 provoca la maturazione delle cellule B attivate e la loro trasformazione in plasmacellule che secernono anticorpi.

L'interferone attrae e attiva i macrofagi, che iniziano a fagocitare e distruggere più attivamente i microrganismi invasori.

Il trasferimento di un gran numero di antigeni processati dal macrofago garantisce la proliferazione e la differenziazione dei linfociti B verso la formazione di plasmacellule che producono anticorpi specifici contro un tipo specifico di antigene (Figura 13).

Per riassumere, le risposte cellulari e umorali non operano in modo autonomo. Di norma, entrambi i tipi di risposta immunitaria vengono realizzati contemporaneamente nel corpo. Il riconoscimento di antigeni di diversa natura da parte delle cellule T e B, una varietà di reazioni e forme di risposta forniscono, in generale, una potente protezione del corpo per tutta la sua vita.

Di seguito sono riportate le figure che mostrano le interazioni delle cellule immunocompetenti nell'immunità cellulare e umorale.

Figura 13 - Principali processi che si verificano durante una reazione immunitaria

1.1. REAZIONE DI AGLUTINAZIONE (RA)

REAZIONE DI AGLUTINAZIONE (RA)

Per la sua specificità, facilità di esecuzione e dimostrabilità, la reazione di agglutinazione si è diffusa nella pratica microbiologica per la diagnosi di molte malattie infettive.

La reazione di agglutinazione si basa sulla specificità dell'interazione degli anticorpi (agglutinine) con intere cellule microbiche o di altro tipo (agglutinogeni). Come risultato di questa interazione si formano particelle e agglomerati che precipitano (agglutinano) sotto forma di scaglie.

La reazione di agglutinazione può coinvolgere sia batteri vivi che uccisi, spirochete, funghi, protozoi, rickettsie, nonché globuli rossi e altre cellule. La reazione avviene in due fasi: la prima (invisibile) specifica, combinazione di antigene e anticorpi, la seconda (visibile) non specifica, incollaggio di antigeni, cioè formazione di agglutinati.

Un agglutinato si forma quando un centro attivo di un anticorpo bivalente si combina con il gruppo determinante di un antigene. La reazione di agglutinazione, come ogni reazione sierologica, avviene in presenza di elettroliti.

Esternamente, la manifestazione di una reazione di agglutinazione positiva ha un duplice carattere. Nei microbi flagellati che hanno solo l'antigene somatico O2, le cellule microbiche stesse si uniscono direttamente. Questa agglutinazione è detta a grana fine. Si verifica entro 18 22 ore. v

I microbi flagellati hanno due antigeni: l'antigene somatico O2 e l'antigene flagellare H2. Se le cellule vengono incollate insieme dai flagelli, si formano scaglie grandi e sciolte e questa reazione di agglutinazione viene chiamata a grana grossa. Si verifica entro 2 4 ore.

La reazione di agglutinazione può essere eseguita sia allo scopo di determinare qualitativamente e quantitativamente anticorpi specifici nel siero del paziente, sia allo scopo di determinare la specie dell'agente patogeno isolato. v

La reazione di agglutinazione può essere eseguita sia in una versione espansa, che consente di lavorare con siero diluito a un titolo diagnostico, sia nella versione di reazione indicativa, che consente, in linea di principio, di rilevare anticorpi specifici o determinare la specie del agente patogeno.

Quando si esegue una reazione di agglutinazione dettagliata, per rilevare anticorpi specifici nel siero del soggetto, il siero da testare viene prelevato ad una diluizione di 1:50 o 1:100. Ciò è dovuto al fatto che gli anticorpi normali possono essere presenti in concentrazioni molto elevate nel siero intero o leggermente diluito e quindi i risultati della reazione potrebbero essere imprecisi. Il materiale testato in questa versione della reazione è il sangue del paziente.

Il sangue viene prelevato a stomaco vuoto o non prima di 6 ore dopo un pasto (altrimenti potrebbero esserci goccioline di grasso nel siero del sangue, rendendolo torbido e inadatto alla ricerca). Il siero sanguigno del paziente viene solitamente ottenuto nella seconda settimana di malattia, raccogliendo sterilmente 3 × 4 ml di sangue dalla vena cubitale (a questo punto è concentrata la quantità massima di anticorpi specifici). Come antigene noto viene utilizzato un diagnosticum preparato da cellule microbiche uccise ma non distrutte di una specie specifica con una struttura antigenica specifica.

Quando si esegue una reazione di agglutinazione dettagliata per determinare la specie e il tipo di agente patogeno, l'antigene è un agente patogeno vivo isolato dal materiale studiato. Sono noti gli anticorpi contenuti nel siero diagnostico immunitario. v

Il siero diagnostico immunitario è ottenuto dal sangue di un coniglio vaccinato. Dopo aver determinato il titolo (la diluizione massima alla quale vengono rilevati gli anticorpi), il siero diagnostico viene versato in fiale con l'aggiunta di un conservante. Questo siero viene utilizzato per l'identificazione mediante la struttura antigenica del patogeno isolato.

OPZIONI DELLA REAZIONE DI AGLUTINAZIONE

Queste reazioni coinvolgono antigeni sotto forma di particelle (cellule microbiche, globuli rossi e altri antigeni corpuscolari), che vengono incollati insieme da anticorpi e precipitano.

Per eseguire una reazione di agglutinazione (RA), sono necessari tre componenti: 1) antigene (agglutinogeno); 2) anticorpo (agglutinina) e 3) elettrolita (soluzione isotonica di cloruro di sodio).

REAZIONE DI AGLUTINAZIONE ORIENTATIVA (PIASTRA) (RA)

Un RA indicativo, o piastra, viene posto su un vetrino a temperatura ambiente. Per fare ciò, utilizzare una pipetta Pasteur per applicare separatamente sul vetro una goccia di siero con una diluizione 1:10 1:20 e una goccia di controllo della soluzione isotonica di cloruro di sodio. Le colonie o una coltura giornaliera di batteri (una goccia di diagnosticum) vengono introdotte in entrambe le anse batteriologiche e miscelate accuratamente. Le reazioni vengono prese in considerazione visivamente dopo pochi minuti, talvolta utilizzando una lente d'ingrandimento (x5). Con RA positivo si nota la comparsa di scaglie grandi e piccole in una goccia di siero; con RA negativo il siero rimane uniformemente torbido.

REAZIONE DI EMAGLUTINAZIONE INDIRETTA (PASSIVA) (RNGA, RPGA)

La reazione viene eseguita: 1) per rilevare polisaccaridi, proteine, estratti di batteri e altre sostanze altamente disperse, rickettsie e virus, i cui complessi con agglutinine non sono visibili nell'artrite reumatoide convenzionale, oppure 2) per rilevare anticorpi nel siero di pazienti contro queste sostanze altamente disperse e i microrganismi più piccoli.

Per agglutinazione indiretta o passiva si intende una reazione in cui gli anticorpi interagiscono con antigeni pre-adsorbiti su particelle inerti (lattice, cellulosa, polistirene, ossido di bario, ecc. o globuli rossi di pecora, gruppo sanguigno umano I(0)).

Nella reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA), i globuli rossi vengono utilizzati come trasportatori. I globuli rossi caricati con l'antigene si uniscono in presenza di anticorpi specifici contro questo antigene e precipitano. Gli eritrociti sensibilizzati con l'antigene vengono utilizzati nell'RPGA come diagnostico eritrocitario per la rilevazione di anticorpi (sierodiagnosi). Se i globuli rossi sono carichi di anticorpi (anticorpo diagnostico eritrocitario), possono essere utilizzati per rilevare gli antigeni.

Messa in scena. Nei pozzetti delle piastre di polistirolo vengono preparate una serie di diluizioni seriali di siero. Aggiungere 0,5 ml di siero ovviamente positivo nel penultimo pozzetto e 0,5 ml di soluzione fisiologica (controlli) nell'ultimo pozzetto. Aggiungere quindi 0,1 ml di soluzione eritrocitaria diluita in tutti i pozzetti, agitare e porre in termostato per 2 ore.

Contabilità. In caso positivo i globuli rossi si depositano sul fondo del foro sotto forma di uno strato uniforme di cellule con il bordo ripiegato o frastagliato (ombrello rovesciato); in caso negativo si depositano sotto forma di bottone o anello .

1.2. REAZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE. LISI,
REAZIONE OPSONOFAGOCITICA, REAZIONE DI IPERSENSIBILITÀ

REAZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE DELL'ESOTOSINA CON ANTITOSSINA (RN)

La reazione si basa sulla capacità del siero antitossico di neutralizzare l'effetto dell'esotossina. Viene utilizzato per la titolazione di sieri antitossici e la determinazione dell'esotossina.

Quando si titola il siero, una certa dose della tossina corrispondente viene aggiunta a diverse diluizioni del siero antitossico. Quando l'antigene è completamente neutralizzato e non sono presenti anticorpi non spesi, si verifica la flocculazione iniziale. La reazione di flocculazione può essere utilizzata non solo per la titolazione del siero (ad esempio della difterite), ma anche per la titolazione della tossina e del tossoide. La reazione di neutralizzazione delle tossine con antitossina è di grande importanza pratica come metodo per determinare l'attività dei sieri terapeutici antitossici. L'antigene in questa reazione è una vera esotossina.

La concentrazione del siero antitossico è determinata dalle unità convenzionali di AE.

1 AE di siero botulinico, la sua quantità neutralizza 1000 DLM di tossina botulinica. La reazione di neutralizzazione per determinare la specie o il tipo di esotossina (per la diagnosi di tetano, botulismo, difterite, ecc.) Può essere effettuata in vitro (secondo Ramon) e quando si determina la tossigenicità delle cellule microbiche - in un gel ( secondo Ouchterlony).

Reazione di lisi (RL)

Una delle proprietà protettive del siero immunitario è la sua capacità di dissolvere i microbi o gli elementi cellulari che entrano nel corpo.

Gli anticorpi specifici che causano la dissoluzione cellulare (lisi) sono chiamati lisine. A seconda della natura dell'antigene, possono essere batteriolisine, citolisine, spirochetolisine, emolisine, ecc.

Le lisine manifestano il loro effetto solo in presenza di un ulteriore fattore di complemento. Il complemento, come fattore di immunità umorale aspecifica, si trova in quasi tutti i fluidi corporei, ad eccezione del liquido cerebrospinale e del liquido della camera anteriore dell'occhio. Nel siero del sangue umano si nota un contenuto abbastanza elevato e costante di complemento, mentre in grande quantità nel siero di cavie. In altri mammiferi, il contenuto del complemento nel siero sanguigno è diverso.

Il complemento è un sistema complesso di proteine ​​del siero di latte. È instabile e collassa a 55 gradi per 30 minuti. A temperatura ambiente il complemento viene distrutto entro due ore. Molto sensibile agli scuotimenti prolungati, agli acidi e ai raggi ultravioletti. Tuttavia, il complemento viene conservato a lungo (fino a sei mesi) allo stato essiccato a basse temperature. Il complemento promuove la lisi delle cellule microbiche e dei globuli rossi.

Viene fatta una distinzione tra le reazioni di batteriolisi ed emolisi.

L'essenza della reazione di batteriolisi è che quando uno specifico siero immunitario si combina con le sue corrispondenti cellule microbiche viventi omologhe in presenza di complemento, avviene la lisi microbica.

La reazione di emolisi è che quando gli eritrociti vengono esposti ad un siero specifico che ne è immune (emolitico) in presenza di complemento, si osserva la dissoluzione degli eritrociti, cioè emolisi.

La reazione di emolisi nella pratica di laboratorio viene utilizzata per determinare l'intervallo del complemento e per tenere conto dei risultati delle reazioni diagnostiche di fissazione del complemento. Il titolo del complemento è la sua quantità più piccola, che provoca la lisi dei globuli rossi entro 30 minuti in un sistema emolitico in un volume di 2,5 ml. La reazione di lisi, come tutte le reazioni sierologiche, avviene in presenza di un elettrolita.

REAZIONI DI IPERSENSIBILITÀ (ALLERGICHE)

Alcune forme di antigene, in seguito a ripetuti contatti con il corpo, possono causare una reazione specifica nella sua base, ma include fattori cellulari e molecolari non specifici di una risposta infiammatoria acuta. Esistono due forme conosciute di ipersensibilità: ipersensibilità di tipo immediato (IHT) e ipersensibilità di tipo ritardato (DTH). Il primo tipo di reazione avviene con la partecipazione di anticorpi e la reazione si sviluppa entro e non oltre 2 ore dopo il contatto ripetuto con l'allergene. Il secondo tipo si realizza con l'ausilio delle cellule T infiammatorie (Tgc) come principali effettori della reazione, garantendo l'accumulo di macrofagi nell'area dell'infiammazione; la reazione si manifesta dopo 6-8 ore e oltre.

Lo sviluppo di una reazione di ipersensibilità è preceduto dall'incontro con un antigene e dal verificarsi di sensibilizzazione, ad es. la comparsa di anticorpi, linfociti attivamente sensibilizzati e anticorpi citofilici sensibilizzati passivamente di altri leucociti (macrofagi, granulociti).

Le reazioni di ipersensibilità hanno tre fasi di sviluppo: immunologica; patochimico; fisiopatologico.

Nella prima fase specifica, l'allergene interagisce con anticorpi e (o) cellule sensibilizzate. Nella seconda fase, le sostanze biologicamente attive vengono rilasciate dalle cellule attivate. I mediatori rilasciati (istamina, serotonina, leucotrieni, bradichinina, ecc.) Causano vari effetti periferici caratteristici del corrispondente tipo di reazione terza fase.

Reazioni di ipersensibilità di tipo 4

Reazioni di questo tipo sono causate da interazioni intercellulari patogene di cellule T helper sensibilizzate, linfociti T citotossici (cellule T killer) e cellule attivate del sistema fagocitario mononucleare, causate dalla stimolazione prolungata del sistema immunitario da parte di antigeni batterici, in cui è presente un relativa insufficienza del sistema immunitario del corpo per eliminare gli agenti patogeni batterici dalle malattie infettive dell'ambiente interno. Queste reazioni di ipersensibilità causano cavità polmonari tubercolari, la loro necrosi caseosa e intossicazione generale nei pazienti affetti da tubercolosi. La granulomatosi cutanea nella tubercolosi e nella lebbra in termini morfopatogenetici è in gran parte composta da reazioni di ipersensibilità del quarto tipo.

L'esempio più famoso del quarto tipo di reazione di ipersensibilità è la reazione di Mantoux, che si sviluppa nel sito di iniezione intradermica della tubercolina in un paziente il cui corpo e sistema sono sensibilizzati agli antigeni micobatterici. Come risultato della reazione, si forma una densa papula iperemica con necrosi al centro, che appare solo poche ore (lentamente) dopo l'iniezione intradermica di tubercolina. La formazione di una papula inizia con il rilascio di fagociti mononucleari di sangue circolante dal letto vascolare negli spazi intercellulari. Allo stesso tempo inizia l'emigrazione delle cellule polimorfonucleate dal letto vascolare. Successivamente l'infiltrazione da parte dei neutrofili diminuisce e l'infiltrato inizia a consistere prevalentemente di linfociti e fagociti mononucleati. Ciò differisce dalla reazione di Mantoux dalla reazione di Arthus, in cui prevalentemente leucociti polimorfonucleati si accumulano nel sito della lesione.

Nelle reazioni di ipersensibilità di tipo 4, la stimolazione a lungo termine dei linfociti sensibilizzati da parte degli antigeni porta, in luoghi di alterazioni patologiche dei tessuti, al rilascio patologicamente intenso e prolungato di citochine da parte delle cellule T helper. L'intenso rilascio di citochine nei luoghi del danno tissutale provoca l'iperattivazione delle cellule del sistema fagocitico mononucleare situato lì, molte delle quali, in uno stato iperattivato, formano filamenti di cellule epitelioidi e alcune si fondono tra loro per formare cellule giganti. I macrofagi, sulla cui superficie sono esposti antigeni batterici e virali, possono essere distrutti attraverso il funzionamento dei Tkiller (killer naturali).

Il quarto tipo di reazione di ipersensibilità è indotta dal riconoscimento di un antigene batterico estraneo da parte delle cellule T helper ad esso sensibilizzate. Una condizione necessaria per il riconoscimento è l'interazione degli induttori con gli antigeni esposti sulla superficie delle cellule presentanti l'antigene dopo l'endocitosi e l'elaborazione di immunogeni estranei da parte dei fagociti mononucleari. Un'altra condizione necessaria è l'esposizione degli antigeni in combinazione con le molecole di classe I del complesso maggiore di istocompatibilità. Dopo il riconoscimento dell'antigene, le cellule helper sensibilizzate rilasciano citochine e, in particolare, l'interleuchina2, che attiva le cellule killer naturali e i fagociti mononucleari. I fagociti mononucleari attivati ​​rilasciano enzimi proteolitici e radicali liberi dell'ossigeno, che danneggiano i tessuti.

I test allergologici cutanei sono test per determinare la sensibilizzazione del corpo agli allergeni, determinare la sua infezione, ad esempio la tubercolosi, la brucellosi, il livello di immunità collettiva, ad esempio la tularemia. In base alla sede di somministrazione dell'allergene si distinguono: 1) test cutanei; 2) scarificazione; 3) intradermico; 4) sottocutaneo. La reazione clinica ad un allergene durante un test di allergia cutanea è divisa in locale, generale e focale, nonché immediata e ritardata.

Le reazioni locali del mediatore di tipo GNT si verificano dopo 520 minuti, si esprimono sotto forma di eritema e vescica, scompaiono dopo poche ore e vengono valutate con il metodo plus in base alla dimensione dell'eritema, misurata in mm. Le reazioni locali della TOS si verificano entro 24-48 ore, durano a lungo, si presentano sotto forma di infiltrato, talvolta con necrosi al centro, e vengono valutate dalla dimensione dell'infiltrato in mm, anche utilizzando il sistema plus. Con i tipi di HNT citotossici e immunocomplessi, l'iperemia e l'infiltrazione si osservano dopo 3-4 ore, raggiungono un massimo a 6-8 ore e regrediscono dopo circa un giorno. A volte si osservano reazioni combinate.

1.3. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO (FFR)

Questa reazione viene utilizzata negli studi di laboratorio per rilevare anticorpi nel siero sanguigno per varie infezioni, nonché per identificare l'agente patogeno in base alla sua struttura antigenica.

La reazione di fissazione del complemento è una reazione sierologica complessa ed è altamente sensibile e specifica.

Una caratteristica di questa reazione è che il cambiamento nell'antigene durante la sua interazione con anticorpi specifici avviene solo in presenza del complemento. Il complemento viene adsorbito solo sul complesso “antigene anticorpo”. Il complesso “antigene anticorpo” si forma solo se esiste un'affinità tra l'antigene e l'anticorpo nel siero.

L'adsorbimento del complemento sul complesso “antigene-anticorpo” può avere effetti diversi sul destino dell'antigene a seconda delle sue caratteristiche.

Alcuni antigeni subiscono bruschi cambiamenti morfologici in queste condizioni, inclusa la dissoluzione (emolisi, fenomeno di Isaev-Pfeiffer, azione citolitica). Altri modificano la velocità del movimento (immobilizzazione del treponema). Altri ancora muoiono senza improvvisi cambiamenti distruttivi (effetto battericida o citotossico). Infine, l’adsorbimento del complemento potrebbe non essere accompagnato da cambiamenti antigenici facilmente osservabili.

Secondo il meccanismo RSC, avviene in due fasi:

1. La prima fase è la formazione del complesso “antigene-anticorpo” e l'adsorbimento su questo complesso del complemento. Il risultato della fase non è visivamente visibile (interazione dell'antigene e degli anticorpi con la partecipazione obbligatoria del complemento).
2. La seconda fase è un cambiamento nell'antigene sotto l'influenza di anticorpi specifici in presenza di complemento. Il risultato della fase può essere visibile visivamente o non visibile (rilevamento dei risultati della reazione utilizzando un sistema emolitico indicatore (globuli rossi di pecora e siero emolitico).

La distruzione dei globuli rossi da parte del siero emolitico avviene solo se al sistema emolitico viene aggiunto il complemento. Se il complemento è stato precedentemente adsorbito sul complesso antigene-anticorpo, non si verifica l'emolisi degli eritrociti.

Il risultato dell'esperimento viene valutato rilevando la presenza o l'assenza di emolisi in tutte le provette. La reazione è considerata positiva quando l’emolisi è completamente ritardata, quando il liquido nella provetta è incolore e i globuli rossi depositati sul fondo, negativa quando i globuli rossi sono completamente lisati, quando il liquido è intensamente colorato (“vernice” sangue). Il grado di ritardo dell'emolisi viene valutato in base all'intensità del colore del liquido e alla dimensione del sedimento di globuli rossi sul fondo (++++, +++, ++, +).

Nel caso in cui i cambiamenti nell'antigene rimangano inaccessibili all'osservazione visiva, è necessario utilizzare un secondo sistema, che funge da indicatore, consentendo di valutare lo stato del complemento e trarre una conclusione sul risultato della reazione.

Questo sistema di indicatori è rappresentato dai componenti della reazione di emolisi, che comprende eritrociti di pecora e siero emolitico, che contiene anticorpi specifici contro gli eritrociti (emolisine), ma non contiene complemento. Questo sistema indicatore viene aggiunto alle provette un'ora dopo il posizionamento dell'RSC principale. Se la reazione di fissazione del complemento è positiva, si forma un complesso antigene anticorpale che adsorbe il complemento su se stesso. Poiché il complemento viene utilizzato nella quantità necessaria per una sola reazione e la lisi degli eritrociti può avvenire solo in presenza di complemento, quando viene adsorbito sul complesso "antigene-anticorpo", la lisi degli eritrociti nel sistema emolitico (indicatore) avverrà non verificarsi. Se la reazione di fissazione del complemento è negativa, il complesso “antigene-anticorpo” non si forma, il complemento rimane libero e quando viene aggiunto il sistema emolitico avviene la lisi degli eritrociti.

1.4. SONDE DEL DNA. REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR),
METODO IMMUNOENZIMATICO (ELISA), METODO CON ANTICORPI FLUORESCENTI (FFA)

METODI DI SONDAGGIO GENICO

L'intenso sviluppo della biologia molecolare e la creazione di una base metodologica perfetta per la ricerca genetica hanno costituito la base dell'ingegneria genetica. Nel campo della diagnostica è emersa e si sta rapidamente sviluppando una direzione per determinare specifiche sequenze nucleotidiche di DNA e RNA, il cosiddetto gene probing. Tali tecniche si basano sulla capacità degli acidi nucleici di ibridarsi e formare strutture a doppio filamento grazie all'interazione di nucleotidi complementari (AT, GC).

Per determinare la sequenza desiderata di DNA (o RNA), viene creata appositamente una cosiddetta sonda polinucleotidica con una sequenza di basi specifica. Nella sua composizione viene introdotta un'etichetta speciale che consente di identificare la formazione del complesso.

Sebbene il sondaggio genetico non possa essere classificato come un metodo di analisi immunochimica, il suo principio di base (l'interazione di strutture complementari) viene metodicamente implementato allo stesso modo dei metodi indicatori dell'immunodiagnostica. Inoltre, i metodi di sondaggio genetico consentono di reintegrare le informazioni su un agente infettivo in assenza della sua espressione fenotipica (virus incorporati nel genoma, geni “silenziosi”).

Per effettuare l'analisi del DNA, il campione viene denaturato al fine di ottenere strutture a singolo filamento con le quali reagiscono le molecole sonda di DNA o RNA. Per preparare le sonde, vengono utilizzate varie sezioni di DNA (o RNA) isolate da una fonte naturale (ad esempio, un particolare microrganismo), solitamente presentate sotto forma di sequenze genetiche in plasmidi vettoriali, oppure oligonucleotidi sintetizzati chimicamente. In alcuni casi, come sonda vengono utilizzati preparati di DNA genomico idrolizzati in frammenti, a volte preparati di RNA e soprattutto spesso RNA ribosomiale. Come etichetta vengono utilizzati gli stessi indicatori come in vari tipi di analisi immunochimiche: isotopi radioattivi, fluoresceine, biotopo (con ulteriore sviluppo da parte del complesso avidina-enzima), ecc.

L'ordine di analisi è determinato dalle proprietà della sonda disponibile

Attualmente vengono sempre più utilizzati kit commerciali contenenti tutti gli ingredienti necessari.

Nella maggior parte dei casi, la procedura di analisi può essere suddivisa nelle seguenti fasi: preparazione del campione (compresa l'estrazione e la denaturazione del DNA), fissazione del campione su un supporto (molto spesso un filtro a membrana polimerica), preibridazione, ibridazione stessa, lavaggio dei prodotti non legati, rilevamento . In assenza di una preparazione standard della sonda DNA o RNA, questa viene prima ottenuta ed etichettata.

Per preparare un campione, potrebbe essere necessario “coltivare” preliminarmente il materiale da testare per identificare singole colonie di batteri o aumentare la concentrazione di virus in una coltura cellulare. Viene inoltre effettuata l'analisi diretta di campioni di siero sanguigno, urina, cellule del sangue o sangue intero per la presenza di un agente infettivo. Per rilasciare gli acidi nucleici dalle strutture cellulari, viene effettuata la lisi cellulare e in alcuni casi la preparazione del DNA viene purificata utilizzando il fenolo.

La denaturazione del DNA, cioè la sua transizione verso una forma a filamento singolo, si verifica quando viene trattato con alcali. Il campione di acido nucleico viene quindi fissato su un supporto, una membrana di nitrocellulosa o nylon, solitamente mediante incubazione da 10 minuti a 4 ore a 80°C sotto vuoto. Inoltre, nel processo di preibridazione, si ottiene l'inattivazione dei siti di legame liberi per ridurre l'interazione non specifica della sonda con la membrana. Il processo di ibridazione dura dalle 2 alle 20 ore, a seconda della concentrazione di DNA nel campione, della concentrazione della sonda utilizzata e delle sue dimensioni.

Una volta completata l'ibridazione e lavati via i prodotti non legati, viene rilevato il complesso formato. Se la sonda contiene un marcatore radioattivo, per dimostrare la reazione, la membrana viene esposta su pellicola fotografica (autoradiografia). Per le altre etichette vengono utilizzate le procedure corrispondenti.

La più promettente è ottenere sonde non radioattive (le cosiddette fredde). Sulla stessa base è in fase di sviluppo una tecnica di ibridazione che consente di stabilire la presenza di un agente patogeno nelle preparazioni di sezioni e nelle punture dei tessuti, cosa particolarmente importante nell'analisi patomorfologica (ibridazione in situ).

Un passo significativo nello sviluppo dei metodi di sondaggio genetico è stato l'uso della reazione di amplificazione della polimerasi (PCR). Questo approccio consente di aumentare la concentrazione di una sequenza di DNA specifica (preconosciuta) in un campione sintetizzando più copie in vitro. Per effettuare la reazione, al campione di DNA in studio vengono aggiunti un preparato enzimatico della DNA polimerasi, un eccesso di deossinucleotidi per la sintesi e i cosiddetti primer: due tipi di oligonucleotidi con una dimensione di 2025 basi corrispondenti alle sezioni terminali del Sequenza di DNA di interesse. Uno dei primer dovrebbe essere una copia dell'inizio della regione di lettura del filamento di DNA codificante nella direzione di lettura 53, e il secondo dovrebbe essere una copia dell'estremità opposta del filamento non codificante. Quindi, ad ogni ciclo della reazione della polimerasi, il numero di copie del DNA raddoppia.

Per ottenere il legame del primer, è necessaria la denaturazione (fusione) del DNA a 94°C, seguita dal portare la miscela a 40-55°C.

Per eseguire la reazione, sono stati progettati incubatori per microcampioni programmabili per alternare facilmente i cambiamenti della temperatura ottimale per ciascuna fase della reazione.

La reazione di amplificazione può aumentare significativamente la sensibilità dell'analisi durante il sondaggio genetico, il che è particolarmente importante a basse concentrazioni dell'agente infettivo.

Uno dei vantaggi significativi del sondaggio genetico con amplificazione è la capacità di studiare quantità submicroscopiche di materiale patologico.

Un'altra caratteristica del metodo, più importante per l'analisi di materiale infetto, è la capacità di identificare i geni nascosti (silenziosi). I metodi associati all’uso del sondaggio genetico saranno sicuramente introdotti più ampiamente nella pratica della diagnosi delle malattie infettive man mano che diventeranno più semplici ed economici.

I metodi ELISA e RIF sono in gran parte di natura qualitativa o semiquantitativa. A concentrazioni molto basse di componenti, la formazione del complesso antigene-anticorpo non può essere rilevata né visivamente né con semplici mezzi strumentali. L'indicazione del complesso antigene-anticorpo in questi casi può essere effettuata se in uno dei componenti iniziali antigene o anticorpo viene introdotta un'etichetta, che può essere facilmente rilevata in concentrazioni paragonabili alla concentrazione determinata dell'analita.

Come etichette possono essere utilizzati isotopi radioattivi (ad esempio 125I), sostanze fluorescenti ed enzimi.

A seconda dell'etichetta utilizzata, ci sono test radioimmunologici (RIA), test immunologico fluorescente (FIA), test immunoassorbente legato a un enzima (ELISA), ecc. Negli ultimi anni, ELISA ha ricevuto un uso pratico diffuso, che è associato alla possibilità di determinazioni quantitative , elevata sensibilità, specificità e automazione contabile.

I metodi di dosaggio immunoenzimatico sono un gruppo di metodi che consentono il rilevamento del complesso antigene-anticorpo utilizzando un substrato che viene scisso da un enzima e produce un colore.

L'essenza del metodo è combinare i componenti della reazione antigene-anticorpo con un'etichetta enzimatica misurata. L'antigene o l'anticorpo che reagisce viene marcato con un enzima. Sulla base della trasformazione del substrato sotto l'azione dell'enzima, si può giudicare la quantità del componente interagente della reazione antigene-anticorpo. L'enzima in questo caso funge da marcatore della reazione immunitaria e consente di osservarla visivamente o strumentalmente.

Gli enzimi sono tag molto convenienti perché le loro proprietà catalitiche consentono loro di agire come amplificatori, poiché una molecola di enzima può promuovere la formazione di più di 1 × 105 molecole di prodotto della reazione catalitica al minuto. È necessario selezionare un enzima che mantenga a lungo la sua attività catalitica, non la perda legandosi ad un antigene o ad un anticorpo e abbia un'elevata specificità rispetto al substrato.

I principali metodi per produrre anticorpi o antigeni e coniugati marcati con enzimi sono: ingegneria chimica, immunologica e genetica. Gli enzimi più spesso utilizzati per l'ELISA sono la perossidasi di rafano, la fosfatasi alcalina, la galattosidasi, ecc.

Per rilevare l'attività enzimatica nel complesso antigene-anticorpo ai fini della registrazione visiva e strumentale della reazione, vengono utilizzati substrati cromogeni, le cui soluzioni, inizialmente incolori, durante la reazione enzimatica acquisiscono colore, la cui intensità è proporzionale alla quantità di enzima. Pertanto, per rilevare l'attività della perossidasi di rafano nell'ELISA in fase solida, vengono utilizzati come substrato l'acido 5-amminosalicilico, che produce un colore marrone intenso, e l'ortofenilendiammina, che produce un colore giallo-arancio. Per rilevare l'attività della fosfatasi alcalina e della β-galatosidasi, vengono utilizzati rispettivamente nitrofenilfosfati e nitrofenilgalattosidi.

Il risultato della reazione nella formazione di un prodotto colorato viene determinato visivamente o utilizzando uno spettrofotometro che misura l'assorbimento della luce con una determinata lunghezza d'onda.

Esistono molte opzioni per eseguire l'ELISA. Esistono opzioni omogenee ed eterogenee.

In base al metodo di produzione si distinguono metodi ELISA competitivi e non competitivi. Se nella prima fase sono presenti nel sistema solo il composto analizzato e i suoi corrispondenti centri di legame (antigene e anticorpi specifici), il metodo non è competitivo. Se nella prima fase sono presenti il ​​composto analizzato (antigene) e il suo analogo (antigene marcato con enzima), che competono tra loro per legarsi ai centri di legame specifici (anticorpi) che scarseggiano, allora il metodo è competitivo. In questo caso, maggiore è la quantità di antigene da testare contenuta nella soluzione, minore sarà il numero di antigeni marcati legati.

METODO DI ANTICORPI FLUORESCENTI (MFA) o REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA (RIF)

Il metodo dell'immunofluorescenza è il metodo d'elezione per la rilevazione e l'identificazione rapida di un microrganismo sconosciuto nel materiale del test.

Ag + AT + elettrolita = complesso che brilla ai raggi UV

Siero microbico marcato con fluorocromo

Il colorante spesso utilizzato è l'isotiocianato di fluoresceina FITC

Quando si studia questo metodo, viene utilizzato un microscopio a fluorescenza.

Allestimento RIF

Sullo striscio vengono applicati 30 μl di soluzione di anticorpi marcati con FITC.

Riporre il bicchiere in una camera umida e mantenerlo a temperatura ambiente per 20-25 minuti, oppure in termostato a 37°C per 15 minuti.

Lavare il vetro sotto acqua corrente per 2 minuti, risciacquare con acqua distillata e asciugare all'aria.

Una goccia di liquido di montaggio viene applicata sullo striscio essiccato, lo striscio viene coperto con un vetrino coprioggetto e analizzato al microscopio utilizzando un microscopio a fluorescenza o un attacco fluorescente per un microscopio ottico convenzionale.

Gli elementi principali del sistema immunitario del corpo sono i globuli bianchi - linfociti, che esistono in due forme. Entrambe le forme provengono da cellule progenitrici del midollo osseo, cosiddette. cellule staminali. I linfociti immaturi lasciano il midollo osseo ed entrano nel flusso sanguigno. Alcuni di essi vengono inviati al timo (ghiandola del timo), situato alla base del collo, dove maturano. I linfociti che passano attraverso il timo sono noti come linfociti T o cellule T (T per timo). Negli esperimenti sui polli, è stato dimostrato che un'altra parte dei linfociti immaturi si attacca e matura nella borsa di Fabricius, un organo linfoide vicino alla cloaca. Tali linfociti sono noti come linfociti B o cellule B (B da borsa- borsa). Negli esseri umani e in altri mammiferi, le cellule B maturano nei linfonodi e nel tessuto linfoide di tutto il corpo, in modo equivalente alla borsa di Fabricius negli uccelli.

Entrambi i tipi di linfociti maturi hanno sulla loro superficie recettori in grado di “riconoscere” un antigene specifico e legarsi ad esso. Il contatto dei recettori delle cellule B con un antigene specifico e il legame di una certa quantità di esso stimolano la crescita di queste cellule e la successiva divisione multipla; Di conseguenza, si formano numerose cellule di due tipi: plasmacellule e “cellule della memoria”. Le plasmacellule sintetizzano anticorpi che vengono rilasciati nel flusso sanguigno. Le cellule della memoria sono copie delle cellule B originali; hanno una lunga aspettativa di vita e il loro accumulo offre la possibilità di una rapida risposta immunitaria in caso di rientro di questo antigene nell'organismo.

Per quanto riguarda le cellule T, quando i loro recettori legano una quantità significativa di un particolare antigene, iniziano a secernere un gruppo di sostanze chiamate linfochine. Alcune linfochine causano i soliti segni di infiammazione: arrossamento di aree della pelle, aumento locale della temperatura e gonfiore dovuto all'aumento del flusso sanguigno e perdita di plasma sanguigno nei tessuti. Altre linfochine attraggono i macrofagi fagocitici, cellule che possono catturare e fagocitare l'antigene (insieme alla struttura, come una cellula batterica, sulla cui superficie si trova). A differenza delle cellule T e B, questi macrofagi non hanno specificità e attaccano un’ampia gamma di antigeni diversi. Un altro gruppo di linfochine promuove la distruzione delle cellule infette. Infine, un certo numero di linfochine stimolano la divisione di più cellule T, consentendo un rapido aumento del numero di cellule che rispondono allo stesso antigene e rilasciano ancora più linfochine.

Gli anticorpi prodotti dalle cellule B ed entranti nel sangue e in altri fluidi corporei sono classificati come fattori di immunità umorale (dal latino. umorismo– liquido). La difesa dell'organismo, effettuata con l'aiuto delle cellule T, è chiamata immunità cellulare, poiché si basa sull'interazione delle singole cellule con gli antigeni. Le cellule T non solo attivano altre cellule rilasciando linfochine, ma attaccano anche gli antigeni utilizzando strutture contenenti anticorpi sulla superficie cellulare.

Un antigene può indurre entrambi i tipi di risposta immunitaria. Inoltre, esiste una certa interazione tra le cellule T e B nel corpo, con le cellule T che esercitano il controllo sulle cellule B. Le cellule T possono sopprimere la risposta delle cellule B a sostanze estranee innocue per l'organismo o, al contrario, indurre le cellule B a produrre anticorpi in risposta a sostanze nocive con proprietà antigeniche. Il danno o l'insufficienza di questo sistema di controllo può manifestarsi sotto forma di reazioni allergiche a sostanze solitamente sicure per l'organismo.

Fasi della risposta immunitaria

La reazione immunitaria dall’inizio al completamento può essere suddivisa in tre fasi:

Riconoscimento dell'antigene;
formazione di effettori;
parte effettrice della risposta immunitaria.

La base della teoria del riconoscimento specifico dell'antigene sono i seguenti postulati:

1. Sulla superficie dei linfociti sono presenti specifici recettori leganti l'antigene che vengono espressi indipendentemente dal fatto che l'organismo abbia precedentemente incontrato questo antigene.

2. Ogni linfocita ha un recettore con una sola specificità.

3. I recettori che legano l'antigene sono espressi sulla superficie sia dei linfociti T che dei linfociti B.

4. I linfociti dotati di recettori della stessa specificità discendono da una cellula madre e costituiscono un clone.

5. I macrofagi presentano l'antigene al linfocita.

6. Il riconoscimento di “qualcun altro” è direttamente correlato al riconoscimento del “proprio”, cioè Il recettore legante l'antigene del linfocita riconosce sulla superficie del macrofago un complesso costituito da un antigene estraneo e dal proprio antigene di istocompatibilità (MHC).

L'apparato molecolare di riconoscimento dell'antigene comprende antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità, recettori leganti l'antigene dei linfociti, immunoglobuline e molecole di adesione cellulare.

Le fasi principali del riconoscimento antigenico includono:

Stadio non specifico;
riconoscimento dell'antigene da parte delle cellule T;
riconoscimento dell'antigene da parte delle cellule B;
selezione clonale.

Fase non specifica

Il macrofago è il primo a interagire con l'antigene, attuando il tipo di reazione immunitaria filogeneticamente più antica. L'antigene subisce fagocitosi e digestione, che si traducono nello "smontaggio" di grandi molecole nelle loro parti componenti. Questo processo è chiamato "elaborazione dell'antigene". L'antigene processato viene quindi espresso in complesso con le proteine ​​del complesso maggiore di istocompatibilità sulla superficie del macrofago.

Riconoscimento dell'antigene da parte delle cellule T. Helper T riconosce un complesso costituito da un antigene estraneo e dal proprio antigene MHC. La risposta immunitaria richiede il riconoscimento simultaneo sia dell'antigene estraneo che dell'antigene self del MHC.

Riconoscimento dell'antigene da parte delle cellule B. I linfociti B riconoscono gli antigeni attraverso i loro recettori immunoglobulinici. L'antigene può anche essere riprocessato dopo l'interazione con un linfocita B. L'antigene processato viene posizionato sulla superficie della cellula B, dove viene riconosciuto dalla cellula T helper attivata. Il linfocita B non è capace di una risposta indipendente alla stimolazione antigenica, quindi necessita di ricevere un secondo segnale dall'helper T. Gli antigeni verso i quali una reazione immunitaria è possibile solo con un segnale così ripetuto sono chiamati timo-dipendenti. A volte l'attivazione dei linfociti B è possibile senza la partecipazione delle cellule T. Il lipopolisaccaride batterico in alte concentrazioni provoca l'attivazione dei linfociti B. In questo caso, la specificità dei recettori immunoglobulinici dei linfociti B non ha importanza. In questo caso, l'attività mitogenica del lipopolisaccaride funge da secondo segnale per i linfociti B. Tali antigeni sono chiamati antigeni timo-indipendenti di tipo I. Alcuni antigeni lineari (polisaccaridi pneumococcici, polivinilpirrolidone, ecc.) Stimolano anche le cellule B senza la partecipazione dei linfociti T. Questi antigeni rimangono a lungo sulla membrana dei macrofagi specializzati e sono chiamati antigeni timo-indipendenti di tipo II.

Selezione clonale

Quando un antigene entra nel corpo, avviene una selezione di cloni con recettori complementari a questo antigene. Solo i rappresentanti di questi cloni partecipano all'ulteriore differenziazione antigene-dipendente del clone dei linfociti B.

La formazione della componente effettrice della reazione immunitaria avviene attraverso la differenziazione del clone dei linfociti B e la formazione di linfociti T citotossici.

L'interazione tra le cellule nel processo di formazione della risposta immunitaria alla stimolazione antigenica viene effettuata grazie a speciali mediatori solubili: le citochine. Sotto l'influenza di varie citochine prodotte dai macrofagi o dai linfociti T, i linfociti B maturano in cellule che formano anticorpi.

Per i linfociti B, la fase finale della differenziazione è la trasformazione in plasmacellule, che producono un'enorme quantità di anticorpi. La specificità di questi anticorpi corrisponde alla specificità del precursore dei linfociti B del recettore delle immunoglobuline.

Dopo che si è formata la componente effettrice della reazione immunitaria, inizia la sua terza fase. Nella fase finale della risposta immunitaria sono coinvolti gli anticorpi, il sistema del complemento e i linfociti T citotossici, che portano avanti la reazione citotossica.

Il complesso del microrganismo con l'anticorpo innesca la classica via di attivazione del sistema del complemento, con conseguente formazione di un complesso di attacco di membrana (MAC), che provoca danni alla parete cellulare batterica. Inoltre, gli anticorpi neutralizzano le tossine batteriche e, legandosi ai batteri incapsulati, ne facilitano la fagocitosi da parte dei macrofagi. Questo fenomeno è chiamato opsonizzazione. È stato dimostrato che i batteri incapsulati non opsonizzati spesso riescono a evitare la fagocitosi.

Esternamente, la risposta immunitaria si manifesta nello sviluppo di una reazione infiammatoria acuta.

Reazioni immunitarie

Sotto immunità comprendere il sistema di difesa del corpo da tutto ciò che è geneticamente estraneo, siano essi microbi, trapianti (tessuti e organi trapiantati) o cellule proprie modificate antigenicamente, comprese quelle cancerose o normali che sono sopravvissute alla loro vita utile.

Prima di neutralizzare, distruggere ed eliminare (rimuovere) i portatori di estraneità genetica dal corpo, è necessario rilevarli e riconoscerli. Tutte le cellule di un singolo organismo hanno una marcatura speciale (antigeni di istocompatibilità), grazie alla quale vengono percepite dal sistema immunitario come “nostre”. Le cellule che non presentano tali marcature vengono percepite come “estranee” e vengono attaccate e distrutte dal sistema immunitario. Le sostanze estranee e le cellule che causano una risposta immunitaria specifica sono chiamate antigeni. Distinguere antigeni esogeni(proteine, polisaccaridi, polimeri artificiali, virus, batteri e loro tossine, trapianti) e antigeni endogeni, che includono i tessuti del corpo, alterati dai danni, e le cellule mutanti che compaiono costantemente nel corpo umano (si formano fino a 106 cellule mutanti al giorno). Pertanto, il sistema immunitario protegge un organismo multicellulare dall’invasione esterna e dal “tradimento interno” e, quindi, garantisce la costanza genetica di tutte le cellule somatiche che compongono uno specifico organismo individuale.

La risposta immunitaria viene effettuata da cellule immunocompetenti e dai loro prodotti metabolici - mediatori delle reazioni immunitarie. Esistono sistemi immunitari T e B. Il sistema T fornisce prevalentemente protezione antitumorale e antivirale, nonché reazioni di rigetto del trapianto. Il sistema B fornisce principalmente protezione antibatterica umorale e neutralizzazione delle tossine. Il sistema immunitario T è rappresentato da una popolazione di linfociti timo-dipendenti (linfociti T), che hanno diverse specializzazioni:

¨ T-killer (Tk) - cellule killer di cellule geneticamente estranee;

¨ Cellule T helper (Tx) - cellule helper - stimolano, attraverso mediatori helper, la formazione di un clone di cellule T killer antigene-sensibili e di linfociti B;

¨ I T-soppressori (Ts) sono cellule che sopprimono la risposta immunitaria attraverso mediatori soppressori.

L'attività congiunta dei linfociti Tx e Tc determina la direzione, la forza e la durata della risposta immunitaria. Nel periodo iniziale di una normale risposta immunitaria prevale l'attività dei T-helper e, alla fine, dei T-soppressori. L'attività delle cellule immunocompetenti è sotto il controllo di speciali geni della risposta immunitaria: i geni Ir. In particolare, i geni Ir controllano la sintesi di anticorpi e mediatori dell'immunità (aiutanti e soppressori).

Il sistema B è rappresentato da una popolazione di linfociti B che, in risposta a un antigene (stimolazione antigenica), si trasformano in plasmaciti - cellule che sintetizzano anticorpi (immunoglobuline) (Fig. 8.1). I fagociti effettuano la fagocitosi (Fig. 8.2).

Riso. 8.1. Fasi di formazione dell'immunità acquisita:

I - interazione dei linfociti T e B con la partecipazione di un macrofago;

II - la formazione di cellule che immagazzinano informazioni sulla struttura antigenica di un particolare microrganismo e sono in grado di produrre proteine ​​​​specifiche che legano i microrganismi (anticorpi)

Riso. 8.2. Fasi della fagocitosi:

I - avvicinamento del fagocita all'oggetto (complesso antigene-anticorpo);

II - adesione (adesione) - promossa dalle opsonine;

III - cattura dell'oggetto fagocitato;

IV - digestione del complesso antigene-anticorpo

Esistono cinque classi conosciute di immunoglobuline: IgM, IgG, IgA, IgE e IgD, che vengono prodotte in una sequenza rigorosamente definita. L'IgM è un anticorpo a bassa specificità prodotto per primo in risposta a un antigene. Formano un legame debole con l'antigene e mobilitano le plasmacellule per produrre anticorpi altamente specifici (IgG e IgA). Il passaggio dalla sintesi di IgM alla sintesi di IgG e IgA avviene sotto l'influenza delle linfochine (mediatori) secrete dalle cellule T helper. Le IgG si trovano nel siero del sangue e si chiamano anticorpi sierici. Si legano fortemente all'antigene e sono gli anticorpi più abbondanti contro la minaccia antigenica. Le IgA sono secrete dalle mucose del naso, delle vie respiratorie, dell'intestino e del sistema urogenitale. Sono chiamati anticorpi secretori e fungono da “prima linea di difesa” nei siti di introduzione dell’antigene. Nei mammiferi si trasmettono da madre a figlio attraverso il latte materno. Le IgE (reagine) sono sintetizzate principalmente nel tessuto linfoide delle mucose e nei linfonodi dell'intestino e dei bronchi. Hanno un'elevata omocitotropia (affinità per le cellule del proprio corpo) e quindi possono agire come complici di reazioni allergiche. Il ruolo delle IgD non è stato ancora stabilito.

L'effetto delle immunoglobuline sugli antigeni si manifesta nei seguenti modi:

1. Agglutinazione (adesione) e lisi immunitaria- dissoluzione degli antigeni batterici.

Risposta immunitaria

Tali immunoglobuline sono chiamate agglutinine e batteriolisine. Le reazioni di lisi immunitaria si verificano con la partecipazione del complemento, un componente del siero del sangue.

2. Effetto citotossico degli anticorpi(citotossine) - privazione della vitalità cellulare. Questa reazione avviene anche con la partecipazione del complemento.

3. Neutralizzazione delle tossine con anticorpi(antitossine).

4. Opsonizzazione— potenziamento da parte di anticorpi (opsonine) dell'attività fagocitaria di micro e macrofagi.

5. Precipitazione- precipitazione degli antigeni da parte degli anticorpi.

Una risposta immunitaria completa è assicurata dall'interazione cooperativa di linfociti T, linfociti B e macrofagi. L'attivazione dei meccanismi di difesa immunitaria inizia dal momento in cui l'antigene entra nell'organismo. Un macrofago (monocita) cattura un antigene, lo elabora e mostra i suoi determinanti antigenici (strutture che determinano l'unicità e l'estraneità dell'antigene) sulla sua superficie cellulare. L'antigene così processato è 100-1000 volte più immunogenico dell'antigene nativo. Coinvolge ulteriori meccanismi immunitari. I determinanti antigenici presentati dai macrofagi sono riconosciuti dai linfociti B e dalle cellule Tx.

Con la stimolazione antigenica esogena, i linfociti B si trasformano in plasmacellule e iniziano immediatamente a produrre IgM a bassa specificità. Dopo un po ', sotto l'influenza dei mediatori T-helper, le plasmacellule trasformano la sintesi delle immunoglobuline in IgG, che è altamente specifico per un dato antigene, e quindi in IgA. Allo stesso tempo, i linfociti Tx stimolano la formazione di un clone di linfociti B, in cui si forma la memoria immunitaria per questo antigene. In questo modo è assicurato immunità attiva.

I linfociti Tx stimolano la chemiotassi positiva dei leucociti neutrofili (microfagi) al sito dell'antigene, che è un meccanismo importante nella neutralizzazione dei batteri.

La stimolazione antigenica endogena coinvolge i linfociti Tk nella risposta immunitaria. Come risultato della cooperazione di un macrofago, T-helper e T-killer, quest'ultimo acquisisce la capacità di moltiplicarsi, creando una popolazione di cellule T sensibili all'antigene e distruggendo intenzionalmente gli antigeni. Oltre alle cellule T, gli effetti citotossici vengono effettuati dai linfociti Hk (cellule natural killer), che distruggono gli antigeni cellulari (cellule bersaglio) senza previa cooperazione (Fig. 8.3).

Una risposta immunitaria a tutti gli effetti viene raramente effettuata senza l'interazione delle sue varianti cellulari e umorali. Pertanto, le cellule T killer diventano sensibili all’antigene quando si legano a specifiche immunoglobuline complementari agli antigeni delle cellule bersaglio. I macrofagi opsonizzati dalle immunoglobuline acquisiscono la capacità di attaccare specificamente le cellule bersaglio e di dissolverle.

Questi meccanismi di risposta immunitaria sono anche alla base delle reazioni allergiche.

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Cellule immunitarie e immunoglobuline

Tuttavia, la reazione immunitaria può verificarsi secondo diversi scenari. Inizialmente, il sistema immunitario blocca l'attività di corpi estranei (immunogeni), creando speciali molecole chimicamente reattive (immunoglobuline) che inibiscono l'attività degli immunogeni.

Le immunoglobuline sono create dai linfociti, che sono le cellule principali del sistema immunitario. Esistono due tipi principali di linfociti che, quando attivi insieme, creano tutti i tipi di reazioni immunitarie: i linfociti T (cellule T) e i linfociti B (cellule B). Quando i linfociti T percepiscono materiale estraneo, eseguono essi stessi una risposta immunitaria: distruggono le cellule geneticamente estranee. I linfociti T sono la base dell’immunità cellulare.

Immunità umorale

I linfociti B neutralizzano gli oggetti estranei a distanza creando speciali molecole chimicamente reattive: gli anticorpi. I linfociti B sono la base dell’immunità umorale.

Esistono cinque classi di anticorpi: IgM, IgD, IgE, IgG, IgA. La classe principale delle immunoglobuline è quella delle IgG.

Cos’è una reazione immunitaria o risposta immunitaria?

Gli anticorpi IgG costituiscono circa il 70% di tutti gli anticorpi. Le immunoglobuline IgA costituiscono circa il 20% di tutti gli anticorpi. Gli anticorpi di altre classi costituiscono solo il 10% di tutti gli anticorpi.

Quando si verifica una reazione immunitaria umorale, la distruzione del materiale estraneo avviene nel plasma sanguigno come reazione chimica. Le immunoglobuline create a seguito di una reazione immunitaria possono rimanere per molti anni e decenni, fornendo all'organismo protezione contro la reinfezione, ad esempio parotite, varicella, rosolia. Grazie a questo processo è possibile la vaccinazione.

Le cellule T sono responsabili della risposta immunitaria a due livelli. Al primo livello promuovono il rilevamento di materiale estraneo (immunogeno) e attivano le cellule B per sintetizzare le immunoglobuline. Al secondo livello, dopo aver stimolato le cellule B a produrre immunoglobuline, le cellule T iniziano a degradarsi e a distruggere direttamente il materiale estraneo.

Questa cellula T attivata distrugge la cellula dannosa scontrandosi e attaccandosi ad essa - motivo per cui sono chiamate cellule killer o cellule T killer.

Immunità cellulare

La difesa immunitaria cellulare fu scoperta da I.I. Mechnikov alla fine del XIX secolo. Ha dimostrato che la difesa del corpo contro le infezioni da parte dei microrganismi avviene grazie alla capacità di speciali cellule del sangue di attaccarsi e abbattere i microrganismi dannosi.

Questo processo era chiamato fagocitosi e le cellule killer che danno la caccia ai microrganismi estranei erano chiamate fagociti. La sintesi delle immunoglobuline e il processo di fagocitosi sono fattori specifici dell'immunità umana.

Immunità non specifica

Oltre a quelli specifici, esistono fattori immunitari non specifici. Tra loro:
impedire agli agenti patogeni di passare attraverso l'epitelio;
la presenza nelle secrezioni cutanee e nel succo gastrico di sostanze che influenzano negativamente gli agenti infettivi;
presenza nel plasma sanguigno, nella saliva, nelle lacrime, ecc. speciali sistemi enzimatici che distruggono batteri e virus (ad esempio muramidasi).

Il corpo è protetto non solo dalla distruzione del materiale geneticamente estraneo introdotto in esso, ma anche dalla rimozione dagli organi e dai tessuti degli immunogeni già localizzati in essi. È noto che i virus, i batteri e i loro prodotti di scarto, nonché i batteri morti, vengono trasportati attraverso le ghiandole sudoripare, il sistema urinario e l'intestino.

Un altro meccanismo di difesa non specifico è l’interferone, una struttura proteica antivirale sintetizzata da una cellula infetta. Muovendosi attraverso la matrice extracellulare ed entrando nelle cellule sane, questa proteina protegge la cellula dal virus e dal sistema del complemento, un complesso di proteine ​​costantemente presenti nel plasma sanguigno e in altri fluidi corporei che distruggono le cellule contenenti materiale estraneo.

Le difese dell'organismo si indeboliscono molto spesso a causa del mancato rispetto di uno stile di vita sano o dell'abuso di antibiotici.

Prima dell'uso, è necessario consultare uno specialista.

Le reazioni immunitarie vengono utilizzate negli studi diagnostici e immunologici su persone malate e sane. A tale scopo vengono utilizzati metodi sierologici (dal latino siero - siero e logos - insegnamento), ad es. metodi per studiare anticorpi e antigeni utilizzando reazioni antigene-anticorpo determinate nel siero del sangue e altri fluidi, nonché nei tessuti corporei. La rilevazione di anticorpi contro antigeni patogeni nel siero del paziente consente di formulare la diagnosi della malattia.

Gli studi sierologici vengono anche utilizzati per identificare antigeni microbici, varie sostanze biologicamente attive, gruppi sanguigni, antigeni tissutali e tumorali, complessi immunitari, recettori cellulari, ecc.

Quando un microbo viene isolato da un paziente, l'agente patogeno viene identificato studiando le sue proprietà antigeniche utilizzando sieri immunodiagnostici, ad es. siero sanguigno di animali iperimmunizzati contenente anticorpi antimicrobici. Questa è la cosiddetta identificazione sierologica dei microrganismi.

Reazione di agglutinazione: La reazione di agglutinazione (dal latino oggiutinatio - incollare) è l'incollaggio dei globuli (batteri, globuli rossi, ecc.) da parte degli anticorpi in presenza di elettroliti. La reazione di agglutinazione si manifesta sotto forma di scaglie o sedimenti costituiti da corpuscoli (ad esempio batteri) “incollati insieme” da anticorpi (Fig. 7.37).

La reazione di agglutinazione viene utilizzata per: determinare l'agente patogeno isolato dal paziente; determinazione degli anticorpi nel siero del sangue del paziente; determinazione dei gruppi sanguigni.

1. Determinazione dell'agente patogeno isolato dal paziente

Reazione di agglutinazione approssimativa su vetro. Una sospensione di batteri isolati dal paziente viene aggiunta ad una goccia di siero agglutinante (diluizione 1:20). Si forma un precipitato flocculante.

Una vasta reazione di agglutinazione con un agente patogeno isolato da un paziente.

Alle diluizioni del siero agglutinante viene aggiunta una sospensione di batteri isolati dal paziente.

2. Determinazione degli anticorpi nel siero del paziente:

Una vasta reazione di agglutinazione con il siero del sangue del paziente. Diagnosticum viene aggiunto alle diluizioni del siero del paziente.

— L'agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal calore, che trattengono l'antigene Q) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine.

— L’agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l’antigene H flagellare) è ampia e avviene più rapidamente.

Reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva). rilevare gli anticorpi nel siero sanguigno del paziente utilizzando la diagnostica settica antigenica, che sono globuli rossi con antigeni adsorbiti su di essi

I globuli rossi (o particelle di lattice) con antigeni adsorbiti su di essi interagiscono con i corrispondenti anticorpi nel siero del sangue, facendo sì che i globuli rossi si uniscano e cadano sul fondo della provetta o della cellula sotto forma di una smerlatura sedimento. In una reazione negativa, i globuli rossi si depositano sotto forma di un “bottone”. L'RPHA viene posto in compresse di plastica o in provette con diluizioni del siero del sangue del paziente, a cui viene aggiunto un diagnostico eritrocitario.

A volte viene utilizzato un anticorpo eritrocitario diagnosticum: globuli rossi su cui sono adsorbiti gli anticorpi. Ad esempio, la tossina botulinica può essere rilevata aggiungendo ad esso l'anticorpo eritrocitario botulinum diagnosticum (questa reazione è chiamata reazione di emoagglutinazione indiretta inversa - RONGA).

Reazione di Coombs Test di agglutinazione per la determinazione degli anticorpi anti-Rhesus (test di Coombs indiretto). Alcuni pazienti presentano anticorpi anti-Rhesus, che sono incompleti e monovalenti. Interagiscono specificamente con gli eritrociti Rh-positivi (Rh+), ma non ne causano l'agglutinazione. La presenza di tali anticorpi incompleti viene determinata mediante il test di Coombs indiretto. Per fare ciò, nel sistema vengono aggiunti anticorpi anti-Rh + eritrociti Rh-positivi con anti-globuli e nuovo siero (anticorpi contro le immunoglobuline umane), che provoca l'agglutinazione degli eritrociti

Utilizzando la reazione di Coombs, vengono diagnosticate condizioni patologiche associate alla lisi intravascolare dei globuli rossi, ad esempio la malattia emolitica del neonato: i globuli rossi di un feto Rh positivo si combinano con anticorpi incompleti contro il fattore Rh circolanti nel sangue, che hanno attraversato la placenta da una madre Rh negativa.

Possono essere rilevati anche anticorpi incompleti contro i microbi antigenici.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione Le emoagglutinine virali incollano insieme i globuli rossi. Questa proprietà viene utilizzata nella reazione di emoagglutinazione per l'indicazione e la titolazione dei virus, necessaria per la successiva stadiazione della MRI. La reazione di inibizione dell'emoagglutinazione si basa sul blocco, sulla soppressione degli antigeni virali (emoagglutinine) da parte degli antigeni sierici immunitari, a seguito dei quali i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi. RTGA viene utilizzato per diagnosticare molte malattie virali, i cui agenti causali (virus dell'influenza, morbillo, rosolia, encefalite trasmessa da zecche, ecc.) Possono agglutinare i globuli rossi di vari animali.

Reazione di precipitazione La reazione di precipitazione (dal latino praecipito - precipitare) è la formazione e la precipitazione di un complesso di antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di una torbidezza chiamata precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario. La reazione di precipitazione viene effettuata in provette (reazione di precipitazione ad anello), in gel, mezzi nutritivi, ecc.

Reazione di precipitazione dell'anello La reazione viene effettuata in strette provette di precipitazione: un antigene solubile viene stratificato sul siero immunitario. Con un rapporto ottimale tra antigene e anticorpi, al confine di queste due soluzioni si forma un anello opaco di precipitato. Se come antigeni nella reazione vengono utilizzati estratti di tessuto bolliti e filtrati, questa reazione viene chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli, in cui viene rilevato l'aptene dell'antrace).

Immunoelettroforesi- una combinazione di elettroforesi e immunoprecipitazione: una miscela di antigeni viene introdotta nei pozzetti del gel e separata nel gel mediante elettroforesi, quindi il siero immune viene aggiunto nella scanalatura del gel parallela alle zone di elettroforesi. Gli anticorpi del siero immunitario si diffondono nel gel e formano linee di precipitazione nel punto di “incontro” con l'antigene.

Reazione di flocculazione (secondo Ramon)(dal latino floccus - scaglie di lana) - comparsa di opalescenza o massa flocculante (immunoprecipitazione) in una provetta durante una reazione tossina-antitossina o tossoide-antitossina. Viene utilizzato per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide.

I ceppi dell'agente eziologico della difterite - C, cliphtheriae possono essere tossigeni (producendo un'esotossina) e non tossigeni. La formazione di un'esotossina dipende dalla presenza nei batteri di un profago che trasporta un gene tox che codifica per la formazione di un'esotossina. Quando si verifica la malattia, tutti gli isolati vengono testati per la tossigenicità, ovvero la produzione di esotossina difterica utilizzando una reazione di precipitazione sull'agar.

Reazione di neutralizzazione Gli anticorpi sierici immunitari sono in grado di neutralizzare gli effetti dannosi dei microbi o delle loro tossine su cellule e tessuti sensibili, che è associato al blocco degli antigeni microbici da parte degli anticorpi, cioè alla loro neutralizzazione. La reazione di neutralizzazione (RN) viene effettuata introducendo una miscela antigene-anticorpo negli animali o in oggetti di test sensibili (colture cellulari, embrioni). In assenza degli effetti dannosi dei microrganismi o dei loro antigeni o tossine negli animali e negli oggetti da testare, parliamo dell'effetto neutralizzante del siero immunitario e, quindi, della specificità dell'interazione del complesso antigene-anticorpo.

Reazione di fissazione del complemento La reazione di fissazione del complemento (CFR) consiste nel fatto che quando antigeni e anticorpi corrispondono tra loro, formano un immunocomplesso al quale il complemento (C) è attaccato attraverso il frammento Fc degli anticorpi, cioè. Il complemento è legato dal complesso antigene-anticorpo. Se il complesso antigene-anticorpo non si forma, il complemento rimane libero

L'RSK si effettua in due fasi: 1a fase - incubazione di una miscela contenente antigene + anticorpo + complemento; 2a fase (indicatore) - rilevamento del complemento libero nella miscela aggiungendo ad esso un sistema emolitico costituito da eritrociti di pecora e siero emolitico contenente anticorpi contro di essi. Nella 1a fase della reazione, quando si forma il complesso antigene-anticorpo, il complemento si lega, quindi nella 2a fase non si verificherà l'emolisi degli eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi (la reazione è positiva). Se l'antigene e l'anticorpo non corrispondono tra loro (non c'è antigene o anticorpo nel campione analizzato), il complemento rimane libero e nella 2a fase si unisce al complesso eritrociti-anticorpo antieritrocitario, provocando l'emolisi (reazione negativa). La RSC viene utilizzata per diagnosticare molte malattie infettive, in particolare la sifilide (reazione di Wassermann).

Reazione di immunofluorescenza Reazione di immunofluorescenza (metodo RIF o Koons). Esistono tre tipi di metodo: diretto, indiretto, con complemento. La reazione di Koons è un metodo diagnostico rapido per identificare gli antigeni microbici o determinare gli anticorpi.

Il metodo RIF diretto si basa sul fatto che gli antigeni tissutali o i microbi trattati con sieri immunitari con anticorpi marcati con fluorocromi sono in grado di brillare ai raggi UV di un microscopio a fluorescenza (Fig. 7.61). I batteri in uno striscio trattato con un siero così luminescente si illuminano lungo la periferia della cellula sotto forma di un bordo verde.

Il metodo RIF indiretto prevede la rilevazione del complesso antigene-anticorpo utilizzando anti-globuli e nuovo siero (anti-anticorpo) marcato con fluorocromo. A questo scopo, gli strisci ottenuti da una sospensione microbica vengono trattati con anticorpi provenienti da siero diagnostico antimicrobico di coniglio. Quindi gli anticorpi che non sono legati dagli antigeni microbici vengono lavati e gli anticorpi rimasti sui microbi vengono rilevati trattando lo striscio con anti-globuli e nuovo siero (anti-coniglio) marcato con fluorocromi. Di conseguenza, un complesso microbo + antimicrobico si formano anticorpi di coniglio + anticorpi anti-coniglio marcati con fluorocromo. Questo complesso viene osservato al microscopio a fluorescenza, come nel metodo diretto.

ESSO. Quando si determina l'antigene si aggiunge un antigene ai pozzetti con gli anticorpi assorbiti (ad esempio, siero sanguigno con l'antigene desiderato), si aggiunge un siero diagnostico contro di esso e si aggiungono anticorpi secondari (contro il siero diagnostico) marcati con un enzima, quindi un substrato/cromogeno per l'enzima.

ELISA competitivo per la determinazione degli antigeni (Fig. 7.65).

ELISA competitivo per la determinazione degli anticorpi: gli anticorpi desiderati e gli anticorpi marcati con l'enzima competono tra loro per gli antigeni adsorbiti sulla fase solida.

Immunoblot- un metodo altamente sensibile per l'identificazione delle proteine, basato su una combinazione di elettroforesi e ICH>A o RIA). L'immunoblotting viene utilizzato come metodo diagnostico per l'infezione da HIV, ecc. Gli antigeni dell'agente patogeno vengono separati mediante elettroforesi in un gel di poliacrilammide, quindi vengono trasferiti (blotting - dall'inglese blot - spot) dal gel su carta attivata o su una membrana di nitrocellulosa e sviluppato utilizzando ELISA, l'azienda produce tali strisce con “macchie” di antigeni*. Su queste strisce viene applicato il siero del paziente B). Quindi, dopo l'incubazione, il paziente viene lavato dagli anticorpi non legati e viene applicato il siero contro le immunoglobuline umane marcate con l'enzima C. Il complesso formato sulla striscia [antigene 4 - anticorpo del paziente + anticorpo contro le Ig umane] viene rilevato aggiungendo il substrato cromogenico D), che cambia colore sotto l'azione di un enzima.

Reazione a catena della polimerasi: basato sull'amplificazione, ad es. un aumento del numero di copie di un gene specifico (marcatore) dell'agente patogeno. Per fare ciò, il DNA a doppio filamento isolato dal materiale in studio viene denaturato (“non intrecciato” quando riscaldato) e nuovi filamenti complementari vengono aggiunti (quando raffreddati) ai filamenti di DNA non attorcigliati. Di conseguenza, due geni si formano da un gene. Questo processo di copiatura genetica viene ripetuto molte volte in determinate condizioni di temperatura. L'aggiunta di nuovi filamenti di DNA complementari avviene quando primer (primer di DNA corto a filamento singolo complementari alle estremità da 3" del DNA del gene desiderato), DNA polimerasi e nucleotidi vengono aggiunti ai geni desiderati.

Immunodiagnostica

L’immunodiagnostica è l’identificazione di un agente patogeno, dei suoi derivati ​​immunologicamente attivi o dei fattori di risposta immunitaria dell’organismo sintetizzati in risposta alla loro introduzione, utilizzando farmaci immunodiagnostici specifici.

I farmaci immunodiagnostici, chiamati semplicemente farmaci diagnostici, sono disponibili in diversi tipi : antigene, immunoglobulina e anticorpo.

I diagnostici antigenici sono preparati diagnostici a base di microbi, ovvero virus, tossine, funghi, ecc. (preparati microbi-virali-tossinici), destinati alla determinazione degli anticorpi nelle reazioni immunologiche dirette o dell'antigene in quelle indirette.

I diagnostici anticorpali sono preparati diagnostici a base di globuline di sieri immunitari o anticorpi, progettati per rilevare l'antigene nelle reazioni immunologiche dirette o gli anticorpi in quelle indirette.

I diagnostici delle immunoglobuline sono preparati a base di immunoglobuline sieriche normali, in base alle proprietà effettrici della molecola IG. Le IG sul frammento Fc hanno recettori per legare alcuni agenti, ad esempio il componente C3 del sistema del complemento, la proteina A dello Staphylococcus aureus, i linfociti T e B, i macrofagi e gli anticorpi contro le immunoglobuline, ecc. Questa connessione non viene effettuata dal tipo antigene-anticorpo, ma potrebbe essere necessario determinare la proteina C-reattiva, effettuare una rapida indicazione dello stafilococco utilizzando la proteina A, ecc. Per questi scopi viene preparato un diagnostico immunoglobulinico.

Ad oggi sono stati sviluppati moltissimi immunoreagenti e reazioni immunologiche (più di 200), che richiedono una certa sistematizzazione.

Offriamo la nostra classificazione delle reazioni immunologiche in forma abbreviata. Quando si classificano le reazioni immunologiche, è necessario chiarire : Si verificano in vivo (nel corpo) o all'esterno del corpo, in un esperimento (in vitro). Inoltre, le reazioni immunologiche devono essere divise in cellulari - con la partecipazione di linfociti e umorali - con la partecipazione di anticorpi. Pertanto, un breve schema (generale) delle reazioni immunologiche può essere illustrato come segue :

REAZIONI IMMUNOLOGICHE

perditeIn vivo. riproducibileIn vitro

(reazioni immunitarie) (immunodiagnostica)

umorale cellulare sierologico cellulare

In questa sezione siamo interessati alle reazioni sierologiche riproducibili in vitro. Lo schema completo delle reazioni immunologiche è presentato nella monografia di V.A. Shamardina e altri (1989). Dividiamo le reazioni immunologiche in base alla caratteristica principale : procedendo a seconda del tipo antigene-anticorpo o del tipo effettore. In questa sezione siamo interessati a quelle reazioni che si verificano come tipo antigene-anticorpo. Dovrebbero essere distinti dal fenomeno che visualizza l'interazione degli immunoreagenti (ad esempio il fenomeno dell'agglutinazione, ecc.).

È consigliabile dividere le reazioni basate su un fenomeno specifico in grandi gruppi che hanno una natura comune di interazione (diretta, indiretta, sedimentaria, diffusione, ecc.). Questo schema si riflette nella tabella n. 15.

Tabella n. 15.

Reazioni immunodiagnostiche riproducibili in vitro

Fenomeni di reazioni immunodiagnostiche
Agglutinazioni	Consumo complemento	Immunofluorescenza	Precipitazione	Neutralizzazione	Immunoconiugazione- azioni
gruppi di reazioni immunodiagnostiche
UN. Dritto B. indiretto c.frenata g. assorbimento	B. indiretto V. frenatura	b.indiretto c.frenata	UN. sedimentario B. diffusione	UN. cancellazioni Azioni b.neutralizzazione	UN. Dritto b.indiretto V. frenatura

Fenomeni immunologici

Il fenomeno dell'agglutinazione. Il fenomeno si basa sull'interazione di anticorpi e antigeni con la formazione di un caratteristico precipitato (agglutinato). In questo caso, almeno uno dei reagenti deve essere in forma cellulare o sotto forma di diagnostico cellulare.

Il metodo diretto dovrebbe includere tutte le varianti di interazione delle cellule con gli anticorpi (agglutinazione di batteri, globuli rossi, cellule dei tessuti umani, ecc.). Il metodo diretto comprende tipi di microbi RA, agglutinazione piastrinica, emoagglutinazione, ecc.

Il metodo indiretto comprende tutte le varianti di interazione tra antigene e anticorpi, quando uno di essi è sotto forma di fluido diagnostico (lattice, eritrociti, alizarina, bentonite, carbone, ecc.). Il metodo indiretto consiste in reazioni di emoagglutinazione indiretta a due componenti (IRHA), varianti di coagglutinazione, determinazione dell'antigene in forma adsorbita (POCA), ecc.

Il metodo di inibizione comprende reazioni complesse multicomponente, la prima fase delle quali è la neutralizzazione dell'agente solubile sospettato nel materiale in esame mediante antisiero (o anticorpi del siero in esame - antigene), la seconda fase è la visualizzazione di questa interazione mediante introduzione nella miscela diagnostici omologhi (anticorpi, nel secondo caso - antigenici o sospensione di diagnostici batterici). Il risultato delle interazioni a più stadi sarà un agglutinato. Il metodo di inibizione include reazioni : ritardo dell'agglutinazione diretta e dell'emoagglutinazione (rispettivamente RZA, RTHA), opzioni per l'inibizione dell'emoagglutinazione indiretta (RTIGA), soppressione dell'emoagglutinazione indiretta (IRH), determinazione della classe di anticorpi agglutinanti (ROCA), ecc.

Il metodo per determinare un agente specificamente assorbito comprende reazioni complesse e multicomponenti, il primo stadio dei quali è il legame specifico di un antigene da parte di un anticorpo diagnostico (o anticorpi da parte di un antigene diagnostico), e il secondo stadio è l'agglutinazione del complesso da parte di anticorpi , nel secondo caso da un antigene. Il metodo include reazioni : Metodo di Coombs indiretto, determinazione dell'aptene (HOG), inibizione dell'emoagglutinazione indiretta (RUNGA), reazione di scollamento degli eritrociti (RRE).

Il fenomeno del consumo di complemento. Il fenomeno si basa sull'interazione tra anticorpi e antigene in presenza di complemento

Il metodo diretto comprende tipi di lisi cellulare durante la loro reazione diretta con anticorpi in presenza di complemento (batteriolisi, emolisi, trombocitolisi, ecc.).

Il metodo indiretto include opzioni per la lisi dei globuli rossi nativi caricati con antigene a causa dell'interazione con gli anticorpi in presenza di complemento. Il metodo indiretto è rappresentato dalle reazioni : batteriolisi indiretta (i batteri sono carichi di virus) ed emolisi indiretta (gli eritrociti sono carichi di antigene).

Il metodo con un sistema indicatore comprende un ampio gruppo di reazioni multicomponente, a due o più sistemi basate sulla lisi delle cellule indicatrici. Come cellule indicatrici viene solitamente utilizzato il sistema emolitico (eritrociti nativi di pecora caricati con siero emolitico). La prima fase è l'interazione dell'antigene solubile e degli anticorpi (uno dei componenti è nel materiale del test) in presenza del complemento. La seconda fase è l'introduzione di un sistema di indicatori, in base al cui stato (lisi eritrocitaria o meno) viene giudicata la presenza di anticorpi (o antigene) nel materiale di prova. Il metodo costituisce le reazioni : Bordet-Gengou, consumo del complemento (CPC), varianti di fissazione del complemento (CFV) - in fase liquida e su un mezzo solido (in gel).

Il metodo di inibizione comprende anche un gruppo di reazioni, nella prima fase delle quali il complemento viene adsorbito dal complesso antigene-anticorpo, che viene registrato nella seconda fase, introducendo un antigene cellulare (inibizione del metodo diretto) o un diagnosticum sul eritrociti nativi (inibizione del metodo indiretto) o un sistema eme su eritrociti nativi ram. I metodi includono : reazione di neutralizzazione della lisi microbica (RNLM), inibizione dell'emolisi indiretta (RTNGem), soppressione della fissazione del complemento (RPSC).

Il fenomeno dell'immunofluorescenza. Il fenomeno si basa sull'interazione di cellule adsorbite su un vetrino con sieri immunitari premarcati con un colorante fluorescente. Ciò porta ad un bagliore caratteristico del complesso se osservato al microscopio a fluorescenza.

Il metodo diretto comprende opzioni per l'interazione diretta di cellule (tessuti, microbi, ecc.) con anticorpi marcati, ad esempio reazione di immunofluorescenza diretta (DIFR), reazione di immunofluorescenza in un preparato macinato (RIFPP), ecc.

Il metodo indiretto comprende opzioni per rilevare l'interazione del complesso antigene-anticorpo mediante l'aggiunta di un anticorpo diagnostico marcato. Il metodo include reazioni : anticorpi fluorescenti della cellulosa (RCFA), immunofluorescenza indiretta (RIFN), immunofluorescenza con dischetti di carta (RIFBD), immunofluorescenza del complemento (RIFC).

L'inibizione dell'immunofluorescenza comprende reazioni multicomponente basate sulla competizione per l'interazione con l'antigene omologo degli anticorpi marcati e degli anticorpi del siero in esame: la reazione di quenching dell'immunofluorescenza (RIFT).

Il fenomeno delle precipitazioni. Basato sull'interazione di molecole di antigene e anticorpo solubili in fase liquida o in gel. Ciò porta alla formazione di un aggregato fine (precipitato).

I metodi per la formazione del precipitato nella fase liquida includono reazioni : Provetta Kraus, precipitazione ad anello di Ascoli, precipitazione capillare, flocculazione e varie reazioni sedimentarie (Cahn, Sachs-Vitebsky, ecc.).

Il metodo, basato sull'interazione di molecole di antigene e anticorpo solubili in un gel, secondo il principio della diffusione dei componenti, consiste in reazioni: semplice diffusione unidimensionale e bidimensionale, immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi e sue modifiche.

Il fenomeno della neutralizzazione. Si basa sulla registrazione della reazione degli anticorpi con agenti patogeni (microbi, virus, ecc.) o con le loro tossine. Ciò porta alla neutralizzazione dell'agente patogeno o al suo effetto patogeno sul corpo.

Il metodo di immobilizzazione è rappresentato dalle reazioni : immobilizzazione dei treponemi, adesione immunitaria, immobilizzazione del Vibrio cholerae, inibizione del metabolismo microbico.

Il metodo per estinguere l'effetto patogeno è : neutralizzazione dell'effetto infettivo (negli animali, embrioni di pollo e colture di tessuti) tenendo conto dei risultati della loro interazione in termini di letalità, formazione di placche, emoagglutinazione, proprietà emolitiche della tossina, effetto necrotico della tossina, ecc.

Il fenomeno dell'immunoconiugazione. Basato sull'interazione di antigeni solubili e anticorpi sulla fase solida. La rilevazione del complesso viene effettuata identificando l'etichetta.

Per la natura del marchio, il fenomeno è composto da diverse famiglie : radioimmune (RIA), immunoenzimatico (ELISA), immunomagnetico (IMA), immunospettrale (ISA), ecc.

La famiglia delle reazioni radioimmuni comprende: varianti del test radioimmunometrico (RIA), analisi immunoradiometrica (IRMA), test di radioassorbimento (RIST e RAST), test radioimmune a sandwich solido (TSRIT), ecc.

La famiglia delle reazioni immunoenzimatiche comprende : metodo di potenziamento enzimatico (IFU), metodo immunoassorbente legato a un enzima (ELISA), varianti del test immunoassorbente legato a un enzima sandwich (TSIFA), ecc.

A loro volta questi grandi gruppi di reazioni dovrebbero essere ulteriormente suddivisi in dirette, indirette e di inibizione (prove competitive).

Tipi di reazioni immunologiche

In questa sezione non possiamo presentare l'intero spettro delle reazioni immunodiagnostiche, che oggi sono più di 200. Presentiamo le reazioni selettive secondo la tassonomia (per una o più reazioni, per quasi tutti i gruppi di tutti i fenomeni). .

Fenomeno dell'agglutinazione

Metodo diretto. È il processo di interazione tra anticorpi omologhi e cellule (tessuti, microrganismi, globuli rossi, piastrine, ecc.) con successiva precipitazione del complesso (agglutinato).

Per eseguire la reazione di agglutinazione del RA, è necessario :

1. Solvente: soluzione di cloruro di sodio allo 0,85%.

2. Sospensione batterica nota al 2%.

3. Testare il siero.

Vetrini, anse batteriologiche, lampada ad alcool.

La cultura studiata.

Set di sieri agglutinanti. La reazione di agglutinazione viene eseguita in due varianti : in forma espansa in provette e sotto forma di metodo indicativo - goccia a goccia su un vetrino.

1. Versione ampliata di RA.

La reazione non è attualmente utilizzata.

2. Versione a goccia di RA.

Utilizzato per la determinazione rapida degli anticorpi nel siero del sangue posizionando l'AR su un vetrino con un test diagnostico noto o tipizzando una coltura pura di microbi con un antisiero noto.

Tipizzazione colturale: una goccia di siero noto in diluizione 1:10 (o secondo le istruzioni) viene applicata su un vetrino e una goccia di solvente viene applicata separatamente. La coltura microbica tipizzata viene introdotta nella prima goccia utilizzando un'ansa batterica e distribuita in tutta la goccia.

L'ansa viene bruciata in una lampada ad alcool e la coltura viene nuovamente raccolta, distribuendola nella seconda goccia. Il circuito viene bruciato e messo in posizione. Dopo alcuni minuti, i risultati vengono registrati.

Se la coltura tipizzata è omologa in specificità agli anticorpi nel siero, si osserverà l'aggregazione, ad es. la formazione di scaglie in una goccia è un risultato positivo.

Quando si determinano gli anticorpi, vengono preparate anche due gocce: una dal siero del test e la seconda da una soluzione di cloruro di sodio allo 0,85%. Aggiungere 1 goccia di diagnosticum batterico ad entrambe le gocce (1 miliardo di sospensione). Tra pochi minuti appariranno i risultati dell'AR indicativa. Se nel siero in esame sono presenti anticorpi omologhi al diagnosticum, si osserverà la flocculazione (questo è un risultato positivo). Se il risultato è negativo (assenza di anticorpi nel siero del test), entrambe le gocce rimangono uniformemente torbide.

Metodo indiretto. A causa della grande varietà dei mezzi diagnostici (lattice, eritrociti, Co-, ecc.), è necessario classificarli.

Le differenze tra i diagnostici sono determinate dalla natura dell'agente immunologicamente attivo caricato su un supporto insolubile.

Diagnostici

immunoglobulina anticorpi antigenico

proteina non proteico

I diagnostici sono progettati per rilevare l'antigene e determinare gli anticorpi in varie secrezioni umane, nonché nei fluidi biologici utilizzando reazioni immunologiche semplici e complesse.

1. RNHA - reazione di emoagglutinazione indiretta.

Per impostare una reazione devi avere:

1. Farmaco diagnostico.

2. Solvente: soluzione di cloruro di sodio allo 0,85% contenente tampone fosfato al 2%, pH 7,2 e siero di cavallo normale in un volume dello 0,4%.

3. Pannelli in polistirolo, micropiastre tipo Takachi, pipette graduate, beute, fiale, provette, supporti.

4. Inattivatore per sieri di prova.

Globuli rossi di pecora formalizzati, sospensione al 50%.

Organizzato da RNGA. Questa è una reazione bicomponente, effettuata in 2 varianti : in pannelli di polistirolo (opzione macro), in micropiastre tipo Takachi (opzione micro).

Opzione macro.

La reazione viene effettuata in 2 fasi.

Fase 1. Diluizioni seriali del siero sanguigno del paziente vengono preparate come di consueto in un volume di 0,5 ml nei pozzetti di una piastra di polistirolo. A tale scopo, aggiungere 0,5 ml di solvente a tutti i pozzetti di una fila della piastra e 0,5 ml del siero in esame diluito 1:50 al primo pozzetto. Dal primo pozzetto, 0,5 ml della miscela vengono trasferiti al secondo pozzetto, miscelati e 0,5 ml vengono trasferiti al terzo, ecc. L'ultimo pozzetto viene lasciato come pozzetto di controllo (senza siero). Il siero può essere trasferito mediante pipetta o dispenser da 0,5 ml.

Fase 2. Il diagnostico eritrocitario antigenico (AED) viene aggiunto a tutti i pozzetti in 0,5 ml di sospensione allo 0,5% o secondo le istruzioni. Contabilità dei risultati dopo 1,5-2,0 ore (vedi tabella n. 17).

Micrometodo. Preparare diluizioni seriali del siero in esame in un volume di 0,05 ml in una micropiastra tipo Takachi, come indicato in precedenza. Il trasferimento di 0,05 ml nei pozzetti viene effettuato utilizzando un dispenser o un mixer con un volume di testa di 0,05 ml. L'ultima buca è il controllo. Una goccia (0,025 ml) di diagnosticum allo 0,5% viene aggiunta a tutti i pozzetti. Tenendo conto della reazione di emoagglutinazione dopo 1,5-2,0 ore.

Tabella n. 17.

Schema di realizzazione di una versione ampliata della RNGA

ingredienti	Bene numeri e quantità degli ingredienti, in ml
Ricercato siero, 1:50
Solvente
Ricevuto allevamento
DAE, sospensione al 5%.
Risultato RNGA
Titolo RNGA	Il titolo RNGA è una diluizione del siero di 1:3200

Nel primo e nel secondo caso, invece del siero in esame, si può titolare un altro materiale di prova contro un antigene (coproestratto, urina, ecc.) e si può aggiungere un anticorpo eritrocitario diagnostico (ATED).

I risultati dell’RNGA vengono presi in considerazione secondo il seguente schema:

1. Agglutinare a ++++. I globuli rossi coprono l'intero fondo del foro con un ampio "ombrello".

2. Agglutinare a +++. I globuli rossi coprono quasi l'intero fondo del foro.

3. Agglutinare su ++. Il sedimento è piccolo, al centro del buco.

4. Non c'è agglutinato sul fondo o ha la forma di un piccolo anello. Questo è un risultato negativo.

Con risultato positivo si ottiene un agglutinato a forma di ombrello quando gli anticorpi del siero in esame reagiscono con il diagnostico antigenico. Se nel siero non sono presenti anticorpi, tutti i pozzetti avranno una reazione negativa sotto forma di un piccolo anello.

Utilizzando RNGA è possibile determinare fino a 15mila cellule (microbo della peste), fino a 1 milione di cellule (Escherichia, Proteus, ecc.) e più corpi microbici o da 0,01 a 0,0001 μg per ml di antigene solubile. Svantaggio del metodo : Dell'intera massa di anticorpi o antigeni attivi, viene determinata solo una parte di essi, i cosiddetti completi o agglutinanti. RNGA è stato sviluppato nel 1945 da Middlebrook e Dubos.

La stadiazione a goccia dell'RNGA viene effettuata in accordo con quanto descritto per l'AR, esclusa la tipizzazione; il diagnosticum non è batterico, ma AED.

Reazione di coagglutinazione (RCoA).

È noto che la proteina di superficie A dello Staphylococcus aureus ceppo Covan 1 può legarsi a un sito sul frammento Fc delle IgG umane, di cavia, ecc.. Allo stesso tempo, i frammenti Fab delle IgG con il centro attivo degli anticorpi sono liberi e disponibile per l'interazione con microbi, tossine, ecc. In questo modo, ottenere un anticorpo diagnostico mirato, poiché in altri casi di preparazione di diagnostici gli anticorpi verranno localizzati in modo casuale sul trasportatore.

Una coltura giornaliera del ceppo Covan 1 viene lavata via dall'agar con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,85% e lavata due volte mediante centrifugazione a 3000 vol. al minuto per 15 minuti, portando la sospensione batterica al 10%. Fissare e uccidere le cellule facendo bollire per 1 min.

Ad un volume di sospensione di stafilococco al 10%, aggiungere un volume uguale di siero immune ad una diluizione di 1:20, specifico per l'agente rilevabile nel materiale del test (ad esempio, Shigella zonna), sospensione impoverita (adsorbita) di stafilococco saprofita , al fine di rimuovere gli anticorpi anti-stafilococco. La miscela viene incubata a temperatura ambiente per 30 minuti e lavata due volte mediante centrifugazione. Il sedimento stafilococcico deve essere risospeso e poi conservato con sodio azide allo 0,1%. Pertanto, è stato preparato un anticorpo Co-diagnosticum.

Mettere due gocce su un vetrino : La prima goccia è un coproestratto testato per Shigella zonne e la seconda goccia è una soluzione di cloruro di sodio allo 0,85%. Aggiungere 1 goccia di Co-diagnosticum preparato ad entrambe le gocce. Entro 40-60 secondi compaiono delle scaglie (questa è una reazione positiva se nel materiale è presente Shigella sonne). Il controllo mostrerà una torbidità uniforme. In assenza di Shigella sonne (nel nostro esempio), l'esperimento avrà la stessa torbidità fine uniforme del controllo.

Inibizione del metodo. Si tratta di reazioni complesse a due stadi e multicomponente.

HAI - reazione di inibizione dell'emoagglutinazione.

Questa reazione si riferisce all'inibizione di un gruppo diretto di reazioni, è utilizzata principalmente in virologia e si riferisce anche al fenomeno della neutralizzazione, dove verrà descritta.

BRTBA - reazione di inibizione dell'agglutinazione batterica.

La reazione non viene applicata.

RTNHA 1 - reazione di inibizione dell'emoagglutinazione indiretta 1.(Sinonimi : RNAg - se il diagnostico è un anticorpo, RNAb - se il diagnostico è antigenico).

Il metodo viene eseguito in 4 fasi.

Fase 1. Una dose di lavoro di antisiero viene preliminarmente selezionata eseguendo un RNGA convenzionale con AED. Viene determinato il titolo di questo antisiero (la diluizione massima che dà un risultato positivo con l'AED). Come dose di lavoro viene utilizzata una diluizione 3-4 volte più concentrata del titolo RNHA.

Fase 2. Diluizioni seriali del materiale di prova per l'antigene vengono preparate come di consueto, in un volume di 0,25 ml nella quantità di 6 pozzetti in pannelli di polistirene, lasciando il sesto pozzetto come controllo per il test diagnostico. Al posto del materiale di prova, nella riga di controllo viene aggiunto un solvente.

Fase 3. Quindi l'antisiero dell'antigene presunto viene aggiunto a tutti i pozzetti di due file in un volume di 0,25 ml in una dose di lavoro. La miscela viene agitata e lasciata per 30 minuti a temperatura ambiente.

Fase 4. Dopo l'esposizione, in tutti i pozzetti viene aggiunta una goccia di una sospensione al 5% di antigene eritrocitario diagnostico, omologo per specificità all'antisiero. Il pannello viene agitato e lasciato per 1,5-2,0 ore a temperatura ambiente. Se nel materiale è presente un antigene, avviene la neutralizzazione dell'antisiero noto nei pozzetti dell'anticorpo, dove l'antigene è ancora in una concentrazione significativa. Ci sarà una reazione negativa in questi pozzetti (Tabelle 18 e 19).

Nei pozzetti successivi, l'antisiero predominerà poiché l'antigene viene ridotto a causa delle sue diluizioni nei pozzetti. Ciò dovrebbe manifestarsi come una reazione positiva (PRGA). Se nel materiale non è presente antigene, tutti i pozzetti saranno positivi per RNGA.

Tabella n. 18.

Selezione della dose di lavoro dell'antisiero per RTNHA 1

ingredienti	Bene numeri e quantità degli ingredienti, ml
Famoso siero 1:100
Solvente
Diluizioni risultanti
Esposizione 45 minuti a temperatura ambiente
Risultato RNGA
Titolo RNGA e dose di lavoro dell'antisiero	Il titolo dell'antisiero è una diluizione di 1:1600 e la dose di lavoro è (1:1600) : 3 = 1:533 .