Metodi per introdurre il DNA ricombinante nelle cellule batteriche. Consegna dei geni nella cellula. Effetto immunostimolante dei dinucleotidi CpG batterici

La tecnica, sviluppata dagli scienziati dell'Università della California, Irvine sotto la direzione del Dr. Peter Donovan e basata su una combinazione di due metodi noti di manipolazione delle cellule staminali embrionali, raddoppia l'efficienza della consegna del DNA alle cellule staminali embrionali umane.

I moderni metodi di introduzione del DNA negli hESC utilizzando la trasfezione chimica, la nucleofezione e l'elettroporazione presentano un grave inconveniente: la bassa efficienza. La consegna di materiale genetico alle hESC utilizzando un'infezione virale è più efficace, ma ha molte conseguenze indesiderabili per le cellule staminali e non può essere definita completamente sicura da un punto di vista medico se le cellule sono destinate a ulteriori trapianti.

Una nuova tecnica basata su una combinazione di nucleofezione di una singola cellula staminale e un metodo ottimizzato per selezionare le colonie transgeniche risultanti garantisce un'espressione tempestiva e stabile dei transgeni nelle cellule. La nucleofezione prevede la formazione di pori nella membrana cellulare mediante impulsi elettrici e la successiva introduzione del DNA nella cellula.

Oltre al gene di interesse, il costrutto del DNA modificante porta un gene che consente un facile tracciamento della cellula trasformata, ad esempio il gene che codifica per la proteina fluorescente verde Renilla umanizzata (hrGFP). Questo metodo di marcatura cellulare consente di osservare il movimento delle cellule trasformate quando vengono trapiantate negli animali.

Potenzialmente, questo metodo potrebbe essere utile per il trattamento di malattie monogeniche causate da mutazioni di un gene in tutte le cellule di una persona malata. Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità, più di 10.000 malattie umane sono di natura monogenica. Milioni di persone in tutto il mondo soffrono di malattie monogeniche, tra cui la malattia di Huntington, l'anemia falciforme, l'emofilia e la fibrosi cistica.

Il nuovo metodo amplierà le possibilità di manipolazione delle cellule hES, rendendo possibile modellare le malattie umane e trovare farmaci adeguati. Utilizzando questa tecnica, gli scienziati saranno in grado di correggere i disturbi genetici nelle cellule staminali e utilizzare cellule sane nella medicina rigenerativa.

Colonia di cellule hES che esprimono proteine ​​fluorescenti verdi hrGFP.

Articolo di Hohenstein KA et al. “Nucleofection Mediates High-efficiency Stable Gene Knockdown and Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells” è disponibile nella versione on-line della rivista Cellule staminali dal 6 marzo 2008.

Come dimostrano numerosi studi, l’uso di vari virus è una soluzione molto efficace, che permette di superare le difese immunitarie dell'organismo, e quindi infettare le cellule, utilizzandole per diffondere il virus. Per eseguire questa procedura, gli ingegneri genetici hanno selezionato i virus più adatti dal gruppo dei retrovirus e degli adenovirus. I retrovirus introducono informazioni genetiche sotto forma di acido ribonucleico (RNA), una molecola simile al DNA che aiuta a elaborare le informazioni genetiche archiviate nel DNA. Non appena è possibile penetrare in profondità nella cosiddetta cellula bersaglio, dalla molecola di RNA si ottiene una copia della molecola di DNA. Questo processo è chiamato trascrizione inversa. Una volta che una nuova molecola di DNA è attaccata a una cellula, tutte le nuove copie delle cellule conterranno questo gene modificato.

Gli adenovirus trasportano le informazioni genetiche direttamente sotto forma di DNA, che viene consegnato a una cellula che non si divide. Sebbene questi virus trasportano il DNA direttamente nel nucleo della cellula bersaglio, il DNA non corrisponde al genoma della cellula. Pertanto, il gene modificato e le informazioni genetiche non vengono trasmessi alle cellule figlie. Il vantaggio della terapia genica effettuata utilizzando gli adenovirus è che è possibile introdurre geni nelle cellule del sistema nervoso e nella mucosa delle vie respiratorie, sempre attraverso un vettore. Inoltre esiste una terza metodica di terapia genica, effettuata attraverso i cosiddetti virus adeno-associati. Questi virus contengono quantità relativamente piccola di informazioni genetiche, e sono molto più difficili da eliminare rispetto ai retrovirus e agli adenovirus. Tuttavia, il vantaggio dei virus adeno-associati è che non provocano alcuna reazione da parte del sistema immunitario umano.

Metodo genealogico dell'antropogenetica

Questo metodo si basa sulla compilazione e analisi dei pedigree. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato dai tempi antichi ai giorni nostri nell'allevamento di cavalli, nella selezione di pregiate linee di bovini e suini, nell'ottenimento di cani di razza, nonché nell'allevamento di nuove razze di animali da pelliccia.

Come metodo di studio della genetica umana, il metodo genealogico iniziò ad essere utilizzato solo dall'inizio del XX secolo, quando divenne chiaro che l'analisi dei pedigree, che tracciano la trasmissione di generazione in generazione di un certo tratto (malattia), può sostituire il metodo ibridologico, di fatto inapplicabile all’uomo.

Quando si compilano gli alberi genealogici, il punto di partenza è la persona, il probando, di cui si sta studiando l'albero genealogico. Di solito si tratta di un paziente o di un portatore di un certo tratto, la cui eredità deve essere studiata. Quando si compilano le tabelle genealogiche, vengono utilizzati i simboli proposti da G. Just nel 1931 (Fig. 6.24). Le generazioni sono indicate con numeri romani, gli individui di una determinata generazione sono indicati con numeri arabi.

Utilizzando il metodo genealogico, è possibile stabilire la natura ereditaria del tratto in studio, nonché il tipo della sua eredità (autosomica dominante, autosomica recessiva, dominante o recessiva legata all'X, legata all'Y). Analizzando gli alberi genealogici per diverse caratteristiche, può essere rivelata la natura collegata della loro eredità, che viene utilizzata nella compilazione delle mappe cromosomiche. Questo metodo consente di studiare l'intensità del processo di mutazione, valutare l'espressività e la penetranza dell'allele. È ampiamente utilizzato nella consulenza genetica medica per prevedere la prole. Tuttavia, va notato che l’analisi genealogica diventa notevolmente più complicata quando le famiglie hanno pochi figli.

Tutti i metodi per ottenere OGM sono suddivisi in diretti (senza vettore) e indiretti (vettore).

Tutti i metodi diretti per la produzione di animali transgenici presentano un numero significativo carenze: intensità di lavoro, uso di attrezzature e reagenti costosi, inserimento spesso casuale di molecole di DNA nel genoma delle cellule di animali trasformati, un gran numero di cellule che muoiono dopo la trasformazione, mosaico del transgene introdotto.

Significativo vantaggio L'uso di metodi diretti ha un'efficienza piuttosto elevata di trasferimento di DNA estraneo, ovvero è possibile trasferire il transgene a un numero maggiore di cellule rispetto ai metodi indiretti.

Requisiti del DNA vettoriale, sua composizione

Il vettore è una molecola di DNA o RNA costituita da due componenti: parte vettoriale(portatore) e clonato gene estraneo. Il compito del vettore è quello di fornire il DNA selezionato alla cellula ricevente, integrarlo nel genoma, consentire l'identificazione delle cellule trasformate e garantire l'espressione stabile del gene introdotto.

Pertanto, il vettore deve essere piccolo, capace di essere mantenuto nella cellula ospite (replicato), copiato più volte (amplificato), esprimere il gene corrispondente (contenere le sequenze regolatrici appropriate), deve avere un gene marcatore che permetta di distinguere tra cellule ibride per la loro efficace selezione; deve poter essere trasferito nella cellula dell'organismo corrispondente.

Insieme al gene di interesse, il geni marcatori, necessario per determinare la transgenicità di un organismo.

Si possono distinguere due gruppi di geni marcatori che permettono di distinguere le cellule trasformate:

• 1. Geni selettivi responsabili della resistenza agli antibiotici (kanamicina, tetraciclina, neomicina, ecc.), agli erbicidi (nelle piante). Questi possono essere geni per l'auxotrofia di alcuni substrati, ecc. Il principio di base di funzionamento di un tale marcatore è la capacità delle cellule trasformate di crescere su un mezzo nutritivo selettivo con l'aggiunta di alcune sostanze che inibiscono la crescita e la divisione delle cellule normali non trasformate.
• 2. Geni reporter che codificano per proteine ​​cellule neutre, la cui presenza nei tessuti può essere facilmente testata.

I geni più spesso utilizzati come reporter sono la β-glucuronidasi (GUS), la proteina fluorescente verde (GFP), la luciferasi (LUC) e la cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT). Ad oggi, i geni più comunemente utilizzati di questo arsenale sono GUS e GFP e, in misura minore, LUC e CAT. Attualmente utilizzato come gene reporter, GUS è un gene modificato dell'Escherichia coli che codifica per una β-glucuronidasi da 68 kDa. GUS è attivo in un'ampia gamma di condizioni ambientali con un valore ottimale a pH 5-8 e 37°C. Può idrolizzare un'ampia gamma di glucuronidi naturali e sintetici, consentendo la selezione di substrati appropriati per la determinazione spettrofotometrica o fluorimetrica dell'attività enzimatica, nonché per la colorazione istochimica in situ dei tessuti (ad esempio, blu). L'enzima è abbastanza stabile: è resistente al calore (l'emivita a 55°C è di circa 2 ore) e all'azione dei detergenti. Non vi è alcuna perdita di attività GUS durante il processo di congelamento-scongelamento. Nelle proteine ​​chimeriche create mediante metodi di ingegneria genetica, GUS solitamente mantiene la sua attività funzionale. Anche nelle cellule viventi la proteina GUS è molto stabile e attiva da alcune ore a diversi giorni.

La GFP (proteina fluorescente verde - proteina fluorescente verde o proteina fluorescente verde) è stata scoperta da Shimomura et al. nel 1962 nella medusa luminescente Aequorea victoria. Il gene GFP è stato clonato nel 1992 da Prasher et al., e nel giro di pochi anni è iniziato l'uso attivo di questo gene come gene reporter nel lavoro con una varietà di organismi pro ed eucariotici. Attualmente, il gene GFP è utilizzato in centinaia di studi in tutto il mondo e il loro numero sta crescendo rapidamente. Una crescita così rapida è causata dalle proprietà speciali della proteina GFP, vale a dire la sua capacità di emettere fluorescenza nella regione visibile (verde) dello spettro quando irradiata con UV a onde lunghe. Questa fluorescenza è causata direttamente dalla proteina e non richiede substrati o cofattori per la sua manifestazione. Grazie a questa proprietà, il gene GFP è un gene reporter molto promettente, che consente una varietà di studi intravitali (non distruttivi) con organismi transgenici.

Dall'anemone di mare Discosoma sp. Recentemente è stata isolata un'altra proteina, DsRed, che emette fluorescenza alla luce rossa. Molte altre proteine ​​fluorescenti simili sono state recentemente isolate dagli scienziati dell'Accademia russa delle scienze da vari polipi di corallo dell'ordine degli antozoi. Può essere denaturato da temperature molto elevate, valori di pH estremi o forti agenti riducenti come Na2SO4. Una volta riportata alle condizioni fisiologiche, la GFP riacquista in gran parte la sua capacità di fluorescenza. Nelle proteine ​​chimeriche create mediante metodi di ingegneria genetica, la GFP solitamente mantiene la sua attività funzionale. Nelle cellule viventi, anche la proteina GFP è molto stabile.

I geni CAT sono responsabili della sintesi della cloramfenicolo acetiltransferasi (isolata da Escherihia coli). Questo enzima catalizza il trasferimento di un gruppo acetile dall'acetil-CoA al cloramfenicolo. Viene determinato istochimicamente dal cambiamento di colore del tessuto dopo l'aggiunta del substrato appropriato.

Il DNA ricombinante viene introdotto nelle cellule riceventi. Nell'ingegneria genetica, tali cellule riceventi svolgono due ruoli. 1. Permettono di cercare cloni di DNA ricombinante sintetizzato nella banca dei geni. 2 Successivamente, tali cellule riceventi possono essere utilizzate per ottenere prodotti target.

Il metodo di introduzione del DNA ricombinante viene preso in considerazione in base al tipo di vettore in cui è stato ottenuto tale DNA ricombinante e nelle cellule di quali organismi deve essere introdotto trasformando una cellula o un protoplasto o utilizzando il metodo dell'elettroporazione. Se il DNA ricombinante viene ottenuto dai fagi, può essere introdotto nel DNA isolato: questa è la transvezione. Puoi introdurre particelle fagiche intatte: questa è un'infezione (cosmidi, fasmidi).

Dott. metodi di scambio genetico: coniugazione, trasduzione.

Nelle cellule vegetali – trasformazione dei protoplasti vegetali, lavorazione di cellule o tessuti vegetali con DNA ricombinante; l'iniezione di DNA ricombinante nel nucleo è ampiamente utilizzata; utilizzo dei liposomi. I liposomi sono strutture sferiche che hanno un guscio lipidico, all'interno del quale è presente il DNA ricombinante. Per l'introduzione nelle cellule animali: infezioni virali, metodo di elettroporazione, microiniezione nel nucleo. Se, dopo l'introduzione del DNA ricombinante, tutte le cellule del corpo lo ereditano, allora si parla di ottenere un organismo transgenico.

Elettroporazione: le cellule o il protoplasto sono esposti a corrente ad alta tensione (2000-4000 volt) per un breve periodo di tempo. Di conseguenza, nella membrana cellulare si formano pori di circa. 30 nm, che può esistere per 1-2 minuti e attraverso il quale il DNA ricombinante può entrare nella cellula. I pori poi si chiudono e il DNA rimane nella cellula. Questo è un metodo universale.

Metodo balistico– sono utilizzati principalmente negli eucarioti. Vengono utilizzate pistole balistiche nelle quali vengono introdotte particelle AK o W sulle quali viene spruzzato DNA ricombinante. Quindi, con l'aiuto di gas inerti in P, tali particelle vengono sparate da una pistola nella coltura cellulare. Secondo vari schemi, alcune particelle entrano nel nucleo e lì viene trattenuto il DNA ricombinante.

Ricerca cloni con DNA ricombinante.

Questa fase è difficile e imprevedibile.

Il metodo più semplice è cercare i cloni in base al fenotipo dopo aver introdotto il DNA ricombinante(ad esempio pigmentazione). È possibile utilizzare test di complementazione, ma è necessario disporre di cellule mutanti difettose nella sintesi del prodotto attivo.

I metodi di ibridazione richiedono la presenza di sonde di DNA o RNA marcate specifiche. Più spesso sono etichettati P 32. Sonde m.b. brevi sequenze oligonucleotidiche che corrispondono alla parte più conservata del gene ricercato. Queste sequenze conservate possono includere fino a 100 nucleotidi per i procarioti e fino a 1000 per gli eucarioti.

Dopo l'introduzione del DNA ricombinante, le colonie formate sul terreno vengono trasferite su uno speciale filtro di nitrocellulosa. Sono sottoposti a lisi e successiva denaturazione del DNA utilizzando alcali. Il DNA si lega strettamente al filtro. Il filtro viene lavato e trattato con una sonda marcata radioattivamente e viene determinato il clone a cui si è legata questa sonda.

Metodi immunochimici: dopo l'introduzione del DNA ricombinante, i cloni vengono lisati e trattati con anticorpi contro il prodotto corrispondente. Tali anticorpi sono etichettati.