Prelievo materiale e test per Treponema pallidum. Treponema pallidum e sifilide Prelievo di materiale e test per il treponema pallidum

Il mondo dei microrganismi è estremamente vario e sistematizzato dai ricercatori. Lo studio del micromondo vivente è stato condotto attivamente nel secolo scorso. Tuttavia, molte malattie non sono state completamente comprese in questo secolo.

Ad esempio, non c’è ancora consenso sull’origine della sifilide. Questa "malattia francese", come la più antica malattia infettiva dell'umanità, secondo M. V. Milich, è nata sulla Terra contemporaneamente all'avvento dell'uomo.

A proposito, M.V. Milich è il principale sifilidologo del Paese dagli anni '60 agli anni '80, autore di numerosi libri e monografie sulla sifilide.

Ufficialmente, la scoperta dell'agente eziologico della sifilide risale al 1905. I microbiologi tedeschi F. Schaudin ed E. Hoffmann hanno determinato una serie di proprietà morfologiche, culturali e biochimiche del Treponema pallidum, nonché alcune caratteristiche di questo microrganismo, che costituiscono la base della tassonomia.

In questo articolo analizzeremo in dettaglio le caratteristiche strutturali, la struttura antigenica, le proprietà biochimiche e fisiologiche dell'agente infettivo che causa la sifilide.

Quindi, l'unico agente eziologico della sifilide umana è Treponema pallidum (treponema pallidum). Appartiene all'ordine Spirochaetales phylum Spirochaetes.

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1. Morfologia del Treponema pallidum

Le cellule di Treponema pallidum sono lunghe 6-15 µm, larghe 0,1-0,2 µm e sono un cilindro protoplasmatico (citoplasma circondato da una membrana citoplasmatica), attorcigliato a spirale. A volte la cellula di un microrganismo assomiglia a un filo sottile a forma di cavatappi.



Figura 1 - Struttura del Treponema pallidum. OM, membrana esterna; Ef (endoflagelli o flagelli periplasmatici); LP 1, 2, lipoproteine; Pg - peptidoglicano; CM - membrana citoplasmatica. (Da Cox DL, Chang P, McDowall AW e Radolf JD: La membrana esterna, non il rivestimento della proteina ospite, limita l'antigenicità del Treponema pallidum virulento. Infect Immun 60: 1076)

Il numero di riccioli va da 8 a 14 pezzi. I riccioli, di dimensioni identiche, vengono preservati durante qualsiasi movimento cellulare, anche quando il treponema si muove lungo o tra altre cellule, ad esempio le cellule del sangue.



Figura 2 - Micrografia elettronica di Treponema pallidum. (Da Fitzgerald TJ, Cleveland P, Johnson RC et al: Microscopia elettronica a scansione di Treponema pallidum (ceppo Nichols) attaccato a cellule di mammifero in coltura. J Bacteriol 130: 1333, 1977.)

Le fibrille si trovano ai poli cellulari, tra la membrana e il citoplasma. Una parte della fibrilla è fissa, la seconda parte rimane libera. Le fibrille formano l'apparato motorio del Treponema pallidum, che consente diversi tipi di movimento in un mezzo liquido:

1. 1 mossa.
2. 2 Rotazione lungo l'asse.
3. 3 Flessione.

Treponema pallidum è un microrganismo gram-negativo. Tuttavia, non si colora secondo Gram, poiché contiene particelle idrofobe che non sono sensibili ai coloranti all'anilina.

Quando colorato secondo Romanovsky-Giemsa, acquisisce un tenue colore rosa. Questa caratteristica è servita come base per il nome specifico dell'agente eziologico della sifilide.

Treponema pallidum subsp pallidum è un microrganismo esigente che ha intervalli ottimali ristretti di pH (7,2-7,4), Eh (-230-240 mV) e temperatura (30-37°C). I treponemi vengono rapidamente inattivati ​​dal calore moderato, dal freddo, dall'essiccazione e dalla maggior parte dei disinfettanti.

Tradizionalmente, il Treponema pallidum era considerato un organismo strettamente anaerobico, ma ora è noto come batterio microaerofilo.

2. Proprietà culturali e biochimiche

Nonostante gli intensi sforzi compiuti negli ultimi 75 anni, il T pallidum pallidum non è stato coltivato con successo in vitro. I microrganismi vitali possono persistere per 18-21 giorni in terreni complessi e una replicazione limitata è stata ottenuta mediante co-coltivazione con cellule di coltura tissutale. Anche le altre tre specie patogene di Treponema non sono state coltivate con successo in vitro.

Quando coltivato, Treponema pallidum perde la sua patogenicità, ma conserva tuttavia alcune proprietà antigeniche (questa caratteristica viene utilizzata per mettere in scena la reazione Wassermann).

La cultura viene coltivata principalmente nei testicoli dei conigli. Il Treponema pallidum si moltiplica nel tessuto testicolare, causando orchite negli animali longevi.

T. pallidum si riproduce per divisione trasversale binaria ad una temperatura di circa 37˚C. Il tempo di generazione in vivo è relativamente lungo (30 ore).

I treponemi non sono molto stabili nell'ambiente esterno.

1. 1 Vivono per alcuni minuti fuori dal corpo umano e muoiono dopo essersi seccati. Pertanto, a una temperatura di 40°C, i treponemi muoiono entro poche ore, a una temperatura superiore a 50°C - entro 15 minuti.
2. 2 In condizioni sfavorevoli, il microrganismo forma forme a L e cisti che, a loro volta, sono in grado di formare nuovamente forme a spirale.

Secondo il tipo di metabolismo, T. pallidum è un chemioorganoeterotrofio. Ciò significa che il treponema pallidum utilizza le sostanze organiche e l'energia dei legami chimici come fonte di energia per la vita.

A causa dell'incapacità del T. pallidum di esistere in vitro, le proprietà biochimiche non sono state ben studiate.

3. Struttura antigenica

T. pallidum ha una struttura antigenica poco studiata. È rappresentato da un antigene proteico termolabile specifico, da un antigene lipidico non specifico e anche da un antigene di natura polisaccaridica.

In poche parole, gli antigeni del Treponema pallidum sono principalmente proteine, lipidi e polisaccaridi della membrana esterna della cellula.

Il lipopolisaccaride (LPS) della parete cellulare batterica svolge un ruolo importante. Svolge funzioni antigeniche e tossiche, essendo un'endotossina del Treponema pallidum.

L'antigene lipidico è simile all'estratto di tessuto cardiaco bovino: la cardiolipina.

4. Fattori di patogenicità

Come le proprietà biochimiche, i fattori di patogenicità dei treponemi non sono stati studiati sufficientemente bene.

Dopo essere entrato nel macroorganismo, T. pallidum rilascia proteine ​​specifiche, lipopoliproteine ​​e lipopolisaccaridi, che mostrano proprietà tossiche dopo la sua morte.

Le lipopoliproteine ​​​​sono coinvolte nell'attivazione del sistema immunitario e le proteine ​​sono simili in alcune proprietà alle emolisine batteriche.

I fattori di patogenicità del treponema pallidum comprendono la capacità di rilasciare endotossine e antigeni lipidici, apparentemente dai lipidi delle membrane mitocondriali, che hanno la proprietà di autoantigeni.

T. pallidum, essendo un batterio gram-negativo, non produce esotossine, ma ha attività tossica contro alcune cellule, ad esempio i neuroblasti.

5. Tipi di immunità

In risposta all'introduzione dell'agente patogeno della sifilide nel corpo umano, si verifica una risposta immunitaria cellulare e umorale.

L'immunità cellulare è associata alla fissazione del Treponema pallidum nelle cellule di organi e tessuti e alla successiva attivazione di macrofagi e linfociti T. Allo stesso tempo, l'agente eziologico della sifilide non viene eliminato dal corpo umano.

L'immunità umorale è caratterizzata dalla formazione di immunoglobuline specifiche. Nelle prime fasi dell'infezione, nel corpo umano si formano IgM. Man mano che l’infezione progredisce, viene attivata la sintesi delle IgG. Le IgA sono sintetizzate in piccole quantità. La partecipazione e la sintesi di IgD e IgE non sono ben studiate.

6. Sensibilità ai farmaci antibatterici

L'agente eziologico della sifilide è sensibile a quasi tutti gli antibiotici, ma i farmaci di scelta sono le penicilline.

La parete cellulare del Treponema pallidum è a base di peptidoglicano, che svolge una funzione protettiva. Questo peptidoglicano è il "bersaglio" del principale farmaco antibatterico destinato al trattamento della sifilide: la penicillina. Gli antibiotici del gruppo delle penicilline rompono i legami tetrapeptidici del peptidoglicano.

Quando un Treponema pallidum in crescita viene esposto a un antibiotico (possibilmente con un'esposizione prolungata), si forma la forma L del batterio. Questa forma è priva di parete cellulare, ma è comunque in grado di riprodursi.

La sensibilità del treponema pallidum ai farmaci antibatterici non è determinata.

7. Diagnosi di laboratorio della sifilide

I metodi di laboratorio per diagnosticare la sifilide possono essere divisi in 2 gruppi:

1. 1 Identificazione dell'agente eziologico della malattia da preparati biologici (contenuto del canale, secrezione purulenta dalle papule, punture dai linfonodi).
2. 2 Reazioni sierologiche.

I test sierologici vengono utilizzati sia per verificare la diagnosi che per valutare l'efficacia della terapia contro la sifilide. La particolarità della sierologia della sifilide si riduce all'assenza di risultati positivi dei test nella fase iniziale della malattia.

Questo è spiegato in modo abbastanza semplice. Pertanto, il periodo di incubazione della sifilide è in media di 3-5 settimane. È stato notato che nelle persone antisociali che abusano di alcol, così come nelle persone con tubercolosi e infezione da HIV, il periodo di incubazione differisce dalla media verso il basso (2 settimane).

Il periodo di incubazione aumenta quando si assumono vari farmaci antibatterici (fino a 6 mesi).

Durante questo periodo, la concentrazione anticorpale non ha il tempo di raggiungere il titolo diagnostico. Tuttavia, una persona infetta può presentare sintomi clinici. Questo tipo di sifilide è chiamato sieronegativo.

La sifilide con un quadro clinico chiaro e la presenza di un titolo anticorpale diagnostico nel sangue (cioè un risultato positivo dei test sierologici) è chiamata sieropositiva. Se non trattata, la sifilide sieropositiva si sviluppa in sifilide secondaria, che dura diversi anni.

8. Rilevamento di T. pallidum nel substrato

8.1. Metodologia per lo studio del T. pallidum nel “campo oscuro”

Un metodo diagnostico popolare è il rilevamento del treponema pallidum in un microscopio a campo oscuro. Questo metodo consente di osservare il treponema e tenere conto delle caratteristiche della sua morfologia e movimento.

Il materiale per la ricerca è prelevato da parti dure o da erosioni di granulomi e papule. Afferrare con attenzione il materiale pre-pulito con un'ansa, mescolarlo con una goccia di soluzione salina e applicarlo su un vetrino.

Il materiale vivente viene studiato al microscopio a campo oscuro. A questo scopo viene utilizzato uno speciale condensatore che consente di studiare il treponema “in tutto il suo splendore”.

8.2. Microscopia di strisci colorati secondo Romanovsky-Giemsa

Per studiare gli strisci fissi (asciutti), viene utilizzato il metodo di colorazione Romanovsky-Giemsa. Con questa colorazione, altri tipi di treponema acquisiscono una tinta viola e T. pallidum - un colore rosa pallido.

Altri metodi di ricerca, come il metodo Buri, l'argentatura secondo Morozov, il metodo semplice della fucsina, ecc., non hanno ricevuto un uso pratico diffuso a causa del loro scarso contenuto di informazioni.

9. Sierodiagnosi

La rilevazione degli anticorpi contro il Treponema pallidum viene effettuata per:

1. 1 Conferma della diagnosi clinica di sifilide;
2. 2 Stabilire una diagnosi di sifilide latente;
3. 3 Monitoraggio dell'efficacia del trattamento;
4. 4 Conferma della guarigione dei pazienti con sifilide;
5. 5 Prevenzione della sifilide ed esame clinico della popolazione (esame del sangue di alcune categorie di persone, ad esempio appartenenti a gruppi a rischio).

I moderni metodi di sierodiagnosi si basano sull'identificazione di anticorpi specifici e non specifici di diverse classi.

9.1. Reazioni sierologiche aspecifiche

Viene eseguito un esame del sangue di laboratorio per rilevare gli anticorpi antilipidi.

• Reazione di Wasserman (RW, RW)

È una classica reazione non specifica. Si basa sul principio della fissazione del complemento. Una reazione viene effettuata con due o tre antigeni. Viene utilizzato per la determinazione sia quantitativa che qualitativa di anticorpi non specifici.

RW viene posizionato con cardiolipina e antigene treponemico. Quest’ultimo consente di aumentare la specificità della reazione e valutare lo stato dell’immunità del paziente.

Nella sifilide primaria, RW ha un valore positivo alla fine del periodo di incubazione, cioè circa 4 settimane dopo l’esordio della malattia.

Quando si studiano pazienti con sifilide secondaria, RW positivo viene rilevato nel 100% dei pazienti e nel 75% dei pazienti nello stadio della sifilide terziaria.

Spesso RW fornisce risultati falsi positivi. Si verificano nelle seguenti condizioni fisiologiche:

1. 1 Per altre infezioni causate da virus, batteri, protozoi;
2. 2 Per processi tumorali maligni;
3. 3 Per la collagenosi;
4. 4 Durante la fine della gravidanza (dopo le 30 settimane) e dopo il parto;
5. 5 Negli individui sani che bevono alcolici e dopo aver mangiato cibi grassi.
• Reazioni basate sull'agglutinazione della cardiolipina (MP - RPR, VDRL)

Queste reazioni sono un metodo di diagnosi rapida della sifilide. In sostanza si tratta di microreazioni effettuate con plasma sanguigno (il metodo più sensibile) e siero inattivato (il secondo più sensibile).

Vengono eseguiti utilizzando il metodo a goccia e richiedono l'uso di un antigene speciale. Questo metodo di sierodiagnosi viene effettuato per selezionare campioni positivi con ulteriore esame degli individui utilizzando reazioni specifiche.

9.2. Sierodiagnosi specifica

La diagnosi si basa su vari metodi per rilevare anticorpi specifici.

9.2.1. Reazione di immunofluorescenza (RIF)

Occupa una posizione intermedia tra tutti i metodi sierodiagnostici specifici. La reazione si basa sui principi dell'identificazione mediante microscopia a fluorescenza di un complesso fluorescente associato all'immunoglobulina del corpo umano sulla superficie della cellula patogena.

Il complesso fluorescente è costituito da globulina umana e tioisocianato di fluoresceina. Esistono diverse modifiche di questa reazione:

1. 1 Reazione di immunofluorescenza con adsorbimento;
2. 2 Reazione IgM - RIF con adsorbimento.

9.2.2. Reazione di immobilizzazione del Treponema pallido (TIRT)

La reazione RIBT si basa sulla capacità del siero sanguigno umano infetto di immobilizzare il Treponema pallidum.

In termini generali, la tecnica può essere spiegata come segue: un antigene preparato dal sifiloma di coniglio e il complemento vengono aggiunti al sangue del paziente.

Gli anticorpi immobilizzanti sono anticorpi tardivi. Raggiungono il massimo entro la fine del primo anno di malattia. Questo metodo non viene utilizzato per la sifilide sieronegativa primaria; è considerato il più laborioso.

9.2.3. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA, ELISA)

Questo metodo diagnostico è automatizzato. In termini di sensibilità e specificità è simile alla reazione di immunofluorescenza con adsorbimento.

9.2.4. Reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA)

Rispetto ad altri studi sierologici, l'RNGA è caratterizzato da una maggiore sensibilità e specificità, soprattutto quando si utilizza un antigene di alta qualità.

Il principio della reazione si basa sull'agglutinazione dei globuli rossi che portano sulla loro superficie gli antigeni del Treponema pallidum, se ad essi vengono aggiunti anticorpi specifici. Il risultato dell'RPGA sarà positivo al termine del periodo di incubazione, ovvero dopo 3-4 settimane.

Tenendo conto di tutte le caratteristiche dell'agente eziologico della sifilide, possiamo evidenziare misure volte a proteggere una persona sana dall'infezione da sifilide.

Poiché la malattia si trasmette attraverso le vie sessuali e di contatto (sifilide domestica), vale la pena sapere che metodi efficaci di protezione sono la contraccezione di barriera e il rispetto delle norme igieniche generali.

Caratterizzato da affetto primario (ulcera), eruzioni cutanee sulla pelle e sulle mucose con conseguente danno a vari organi e sistemi. L'infezione avviene attraverso il contatto sessuale, meno comunemente attraverso il contatto domestico, per via transplacentare e attraverso il sangue. Le malattie si verificano ciclicamente: sifilide primaria, secondaria, terziaria. L’immunità non si sviluppa dopo una malattia. Gli anticorpi sono testimoni del processo.

Tabella 3.42. Rappresentanti patogeni del genere Treponema

Riso. 3.101. Disegno del farmacoTreponemapallidoin uno striscio di cancro. Impregnazione delle spirochete con argento

Riso. 3.100 . PulitoculturaMobiluncus curtisii (Falcivibrium grandis).Colorazione di Gram.

Mobilunco- bastoncini sottili e ricurvi, spesso con estremità a forma di cono (0,4-0,6 x 1,2-4,0 micron). La forma e le dimensioni dei batteri sono variabili. Gram-negativi o gram-variabili, ma la parete cellulare ha la struttura dei batteri gram-positivi. Mobile. Anaerobi obbligati non sporigeni. Difficile da coltivare

T.pallido- fili sottili ritorti a cavatappi (0,18 x 6-20 micron) con 8-12 piccoli riccioli. Secondo Romanovsky-Giemsa, sono dipinti di rosa pallido. Debolmente colorato con coloranti all'anilina, dipinto con argento. Chiaramente visibile al microscopio in campo scuro e a contrasto di fase. Hanno 8-12 flagelli periplasmatici. Movimenti: traslazionali, rotazionali e pendolari. Anaerobi o microaerofili. Nel corpo, l'agente eziologico della sifilide può incistarsi e formare forme L. Gli antigeni sono proteine ​​termolabili specifiche e lipidi non specifici, simili alla cardiolipina, estratti dal cuore bovino.

Diagnostica microbiologica. Batteroscopia in campo oscuro: materiale per l'esame - secrezione del ciclo, linfonodi punteggiati, materiale da eruzioni cutanee. Immunofluorescenza (RIF) di uno striscio colorato con siero immune antitreponemico marcato con fluorocromo. Sierodiagnosi: a) con antigene cardiolipina; b) con antigene treponemico. Per una diagnosi approssimativa vengono utilizzati: reazione VDRL (laboratorio di ricerca sulle malattie veneree) - microprecipitazione dell'antigene cardiolipina con il siero del sangue del paziente (microreazione di precipitazione), reazione Wasserman (WRS). La diagnosi finale viene effettuata: sulla base del RIF con un ceppo tissutale di T. pallidum (metodo indiretto), ELISA e RIBT (reazione di immobilizzazione del treponema pallidum) per rilevare gli anticorpi. Viene utilizzato anche RPGA con diagnosi eritrocitaria treponemica.

Riso. 3.102. T. pallidoin un campo oscuro

L'agente eziologico della sifilide endemica(Treponema pallidum, sottospecie endemica)

Treponema pallidum sottospecie endemicum (T. bejel) è un batterio sottile e contorto (spirocheta) appartenente al genere Treponema. Causa bejel, o sifilide endemica (sifilide non venerea dell'infanzia), accompagnata da un'eruzione cutanea sulla pelle e sulle mucose, dallo sviluppo di condilomi e manifestazioni gommose. Morfologicamente indistinguibile dal Treponema pallidum (T. pallidum). La via di trasmissione è il contatto e la famiglia.

Diagnostica microbiologica. Il metodo batterioscopico consiste nel rilevamento dell'agente patogeno in strisci di essudato, linfonodi regionali e campioni bioptici di lesioni. Il metodo sierologico è simile alla diagnosi sierologica della sifilide, tuttavia, i titoli anticorpali sono inferiori a quelli della sifilide.

Per confermare la diagnosi di sifilide, è necessario concentrarsi non solo sui dati clinici - sintomi oggettivi della malattia - sulla presenza di un'ulcera caratteristica nel periodo primario, eruzioni cutanee chiazzate nel periodo secondario o un'eruzione gommosa e tubercolare nella tarda fase sifilide. A tale scopo vengono utilizzati metodi di diagnosi di laboratorio della sifilide, i più comunemente utilizzati sono la microscopia, l'esame culturale del materiale del paziente, i test sierologici e l'esame istologico di campioni di tessuto biologico. Questo articolo discuterà la diagnosi microscopica della sifilide.

I microrganismi - spirochete - nel corpo di una persona malata si trovano nello spazio interstiziale, tra le fibre del tessuto connettivo, che circondano i letti dei vasi linfatici e sanguigni. Per determinare con precisione la presenza dell'agente eziologico della sifilide, è necessario prelevare da lì il materiale per la ricerca. Naturalmente, ha senso prendere materiale solo dagli elementi dell'eruzione cutanea (soprattutto dalle erosioni e dalle ulcere), dalla superficie dell'ulcera e dalle mucose dei genitali, della bocca e del retto. Inoltre, esistono metodi alternativi, ad esempio la puntura dei linfonodi.

Come raccogliere correttamente il materiale per la ricerca?

Affinché uno striscio per la sifilide abbia successo, prima di prelevare materiale diagnostico dalla superficie di un'ulcera o di un'erosione, è necessario rimuovere tutta la contaminazione in eccesso utilizzando un tampone di garza imbevuto di soluzione salina. Dopo che la superficie dell'elemento si è asciugata, il liquido inizia a filtrare sulla sua superficie, contenente una grande quantità di agente patogeno. Puoi accelerare il processo esercitando una leggera pressione sull'elemento (usando guanti di gomma, ovviamente). Successivamente, viene realizzato uno striscio per la sifilide utilizzando un vetrino che, dopo l'elaborazione, viene esaminato al microscopio. Per ottenere materiale da lesioni non suscettibili all'erosione, viene utilizzato il metodo di raschiatura con un bisturi o un rasoio sterile.

Microscopia in campo oscuro

Uno dei metodi più promettenti ed economici per diagnosticare la sifilide è la microscopia a campo scuro dei treponemi. In questo caso, il farmaco non viene essiccato, lo studio viene effettuato in una goccia di normale soluzione salina isotonica. Uno stretto raggio di luce intensa viene diretto sul vetrino (si ottiene utilizzando un dispositivo speciale: un condensatore). In questo caso la luce cade sul preparato quasi lateralmente e nella lente è visibile un campo scuro. Tuttavia, i corpi microbici nel preparato rifrangono e riflettono la luce - di conseguenza, si verifica un effetto ottico estremamente interessante (basato sul fenomeno Tyndall) - i treponemi iniziano ad assomigliare a spirali mobili luminose con diversi riccioli.

Ricerca utilizzando il metodo Romanovsky-Giemsa

Questo metodo (a differenza della colorazione di Gram) consente di ottenere un'immagine chiaramente visibile del corpo microbico durante la microscopia: questo è uno dei metodi più affidabili per diagnosticare la sifilide. Lo studio viene effettuato come segue: lo striscio di sifilide risultante viene fissato nel reagente di Nikiforov (una miscela di parti uguali di alcol etilico ed etere), quindi colorato con pigmento Romanovsky-Giemsa per 2-5 ore. Dopo aver colorato lo striscio, questo viene essiccato ad una temperatura di 25-28 gradi ed esaminato al microscopio in un mezzo di immersione (olio speciale per immersione, praticamente non rifrange i raggi luminosi). Come risultato della colorazione Romanovsky-Giemsa, l'agente eziologico della sifilide acquisisce una tinta rosa, mentre le restanti spirochete sono dipinte nei toni blu e viola.

Metodo di Morozov (impregnazione dei treponemi con argento)

Forse uno dei metodi più veloci per la diagnosi microscopica della sifilide. Per la sua implementazione richiede diversi reagenti:

• primo – acido acetico (refrigerato), formaldeide al 40% e 100 ml di acqua sterile;
• il secondo - tannino, cento ml di acido fenico e la stessa quantità di acqua distillata;
• il terzo: cento ml di una soluzione di nitrato d'argento in acqua.

L'impregnazione del Treponema con argento (argentatura secondo Morozov) viene eseguita come segue: lo striscio viene asciugato, riempito con il primo reagente per un minuto, dopo di che il vetrino viene lavato con acqua. Poi arriva il turno del secondo reagente: il vetro viene riscaldato per 1 minuto nella fiamma di una lampada ad alcool (moderatamente). Dopo il lavaggio, il vetro viene nuovamente riscaldato fino a quando la macchia diventa marrone. Seguono nuovamente il lavaggio accurato, l'asciugatura e l'esame in un ambiente di immersione. Il treponema pallido dopo l'argentatura secondo Morozov si presenta come corpi microbici immobili neri o marrone scuro. Tutte le loro proprietà morfologiche sono preservate sufficientemente per un'identificazione affidabile.

Nei pazienti con sospetta sifilide, tutte le eruzioni cutanee, soprattutto quelle erosive e ulcerative sulla pelle e sulle mucose della bocca, dei genitali e dell'ano, sono soggette ad esame per Treponema pallidum. Se lo studio degli elementi eruttivi è impossibile o difficile, ricorrere alla puntura dei linfonodi.

Il Treponema pallidum si trova nelle fessure dei tessuti, tra le fibre del tessuto connettivo, attorno ai vasi linfatici e sanguigni, nelle pareti e persino nei lumi dei capillari linfatici. Il materiale richiesto per i test batteriologici per il Treponema pallidum è il fluido tissutale (siero). Esistono diversi metodi per ottenere il fluido tissutale dagli elementi eruttivi della sifilide.

Prima di prelevare il materiale per l'esame, la superficie degli elementi erosivi o ulcerosi viene prima accuratamente pulita con un tampone di cotone o garza imbevuto di una soluzione isotonica di cloruro di sodio, quindi asciugata, evitando lesioni per evitare sanguinamento.

Dopo un po ', sulla superficie dell'elemento studiato inizia a secernere un fluido tissutale abbastanza abbondante. Se ciò non accade, puoi accarezzare attentamente la superficie dell'erosione o dell'ulcera con un'ansa batteriologica o una spatola metallica. Il fluido tissutale per l'esame può anche essere ottenuto spremendo (massaggio) con le dita in un guanto di gomma un'erosione o un'ulcera sospetta, nonché creando un relativo vuoto utilizzando un barattolo di birra. In assenza di erosione o ulcerazione delle lesioni, materiale per la ricerca può essere ottenuto scarificandone la superficie con un bisturi. Se è stato effettuato un trattamento locale o non viene riscontrato treponema, al paziente devono essere prescritte medicazioni ad asciugatura umida a base di soluzione isotonica di cloruro di sodio per diversi giorni e quindi riesaminate.

La puntura del linfonodo viene effettuata con il paziente in posizione sdraiata nel rispetto di tutte le regole di asepsi. Per la foratura, utilizzare un ago affilato con un'estremità smussata e una siringa con un pistone ben rettificato. L'ago e la siringa devono essere asciutti. Il linfonodo esaminato viene fissato con il primo e il secondo dito della mano sinistra e con la mano destra viene eseguita una puntura strato per strato della pelle e del linfonodo con una siringa e un ago attaccato ad esso. Viene praticata una puntura lungo l'asse lungo del nodo, l'ago viene fatto avanzare fino all'estremità del nodo, massaggiandolo leggermente. Quindi spingere indietro lentamente l'ago, aspirando contemporaneamente il contenuto del linfonodo con una siringa. Con la cosiddetta “puntura di arricchimento” si consiglia di iniettare 0,1–0,2 ml di una soluzione isotonica sterile di cloruro di sodio nella corteccia del linfonodo, massaggiare il nodo con il movimento del pistone della siringa e quindi aspirare il contenuto . Il linfonodo puntato viene utilizzato per il test del Treponema pallidum secondo il metodo consueto e prima dello studio è consigliabile non mescolarlo su un vetrino con una soluzione isotonica di cloruro di sodio.

Il metodo migliore per rilevare il Treponema pallidum per diagnosticare la sifilide è l'esame microscopico dei preparati nativi (naturali, umidi) in un campo scuro. La ricerca sul campo oscuro si basa sul fenomeno Tyndall: se la luce solare passa attraverso una stretta fessura in una stanza buia, piccole particelle di polvere invisibili sotto la normale illuminazione iniziano a brillare intensamente. Ciò accade perché le particelle di polvere presenti nell'aria riflettono i raggi del sole in direzioni diverse e alcuni di questi raggi cadono nei nostri occhi. Durante l'esame microscopico in un campo oscuro, viene utilizzato uno speciale condensatore che dirige i raggi luminosi dall'illuminatore con un angolo molto piccolo rispetto al piano del tavolino del microscopio, per cui la luce non entra nell'oculare del microscopio e il campo la vista è buia. L'oggetto in esame riflette la luce e diventa chiaramente visibile su uno sfondo scuro. L'esame microscopico in campo oscuro consente di studiare il Treponema pallidum nella sua forma vivente, nonché di differenziarlo dagli altri treponemi sia per caratteristiche morfologiche che per caratteristiche di movimento.

Per ottenere un campo visivo oscurato in assenza di un condensatore speciale, è possibile utilizzare il metodo di M.P. Arkhangelsky. A tale scopo, tra le due lenti del condensatore di Abbe, sulla lente inferiore viene posizionato un cerchio di carta nera spessa in modo tale che lungo il bordo della lente vi sia uno spazio di 2–3 mm. Per garantire che il cerchio non si muova, durante il taglio, lungo il suo bordo vengono lasciate quattro sporgenze di lunghezza tale da appoggiarsi alla montatura metallica della lente.

La preparazione del farmaco per la ricerca in un campo visivo oscurato viene effettuata come segue. Una goccia di essudato sieroso ottenuto dalla superficie dell'elemento in studio viene posta al centro di un sottile vetrino, precedentemente sgrassato con una miscela di parti uguali di alcool ed etere. Per gli studi in campo oscuro, i vetrini non dovrebbero essere più spessi di

1,1–1,2 mm, nessun graffio, completamente pulito. La goccia con il materiale di prova non deve estendersi oltre il coprioggetto. Una uguale goccia di soluzione isotonica di cloruro di sodio viene applicata accanto ad una goccia di essudato sieroso; Dopo aver mescolato velocemente entrambe le gocce, coprirle con un coprioggetto.

In alcuni laboratori, tuttavia, solo l'essudato sieroso viene microscopico con successo senza l'aggiunta di una soluzione isotonica. Si applica una goccia di olio da immersione o di acqua distillata sulla lente superiore del condensatore a campo scuro e si preme contro di essa il preparato preparato. La microscopia si effettua con un obiettivo da 40 e un oculare da 10 o 5.

La sorgente luminosa è installata in modo che il raggio luminoso cada sullo specchio del microscopio.

Dopo aver posizionato il campione sul tavolino del microscopio e installato la sorgente luminosa, il tubo del microscopio con la lente sotto il controllo dell'occhio viene abbassato con attenzione quasi fino al vetro di copertura. Quindi, ruotando lo specchio, ottengono l'illuminazione più brillante del campo visivo e successivamente, senza distogliere lo sguardo dall'oculare, sollevano con molta attenzione il tubo del microscopio finché non appare un campo scuro con particelle solide che brillano al suo interno e in Browniano movimento. Tra questi si possono trovare singoli neutrofili, linfociti e cellule epiteliali. Se il preparato è fortemente contaminato da questi elementi, è meglio prepararne uno nuovo. Treponema pallidum in un campo visivo scuro appare sotto forma di una spirale delicata o di una linea tratteggiata sottile e delicata. Rifrange debolmente la luce e ha una tinta argentata. È importante valutare i movimenti caratteristici del Treponema pallidum. Durante la microscopia, i fili di fibrina non devono essere mescolati con il treponema - lungo

(a grossi riccioli) formazioni che danno l'impressione di essere mobili per lo scorrere del liquido. Per la maggior parte sono molto sottili e di spessore irregolare.

Il Treponema pallidum dovrebbe essere differenziato dagli altri treponemi, che si trovano principalmente sui genitali e nella cavità orale. Sui genitali occorre tenere presente T. refrigens. È molto più spesso del treponema pallido, rifrange la luce più fortemente e presenta pochi riccioli irregolari, ruvidi, larghi, più inclinati e meno profondi. Le sue estremità sono appuntite, i suoi movimenti sono bruschi e irregolari. Dovrebbe essere distinto anche da Treponema pallidum da T. balanitidis, che è simile a T. refrigens, differendo per la sua notevole lunghezza, spessore e avendo 6-10 spirali.

Nell'esame del materiale prelevato dal cavo orale è necessario tenere conto della presenza dei seguenti treponemi:

1) T. microdentium (T. denticola) - è più corto e, di regola, più spesso del treponema pallidum, i suoi riccioli sono un po' appuntiti, angolosi, rifrange la luce più forte, sembra più luminoso, si muove più lentamente, i movimenti di flessione sono rari ;

2) T. buccalis ha 3-10 riccioli larghi, piatti, irregolari, rifrange fortemente la luce, si muove rapidamente, le sue estremità sono smussate;

3) T. vincenti (da Fusospirillum symbiosis) è un treponema sottile e delicato con riccioli piatti e irregolari, talvolta con 2-3 riccioli piatti; i suoi movimenti sono attivi, ma irregolari, brilla più luminosa del pallido trepone.

I treponemi chiari non si colorano bene con i coloranti all'anilina, ma riducono il nitrato d'argento in argento metallico, che si deposita sulla superficie dei treponemi e li rende visibili al microscopio. L'individuazione del Treponema pallidum nei tessuti si basa su questo fenomeno.

Levaditi e il metodo Manueliano. Pezzi di pelle o altri organi, spessi 1–2 mm, vengono fissati in una sagoma al 10% per 24–48 ore, lavati con etanolo al 96% per 12–16 ore, quindi lavati con acqua distillata finché i pezzi non affondano sul fondo della nave. Successivamente, l'impregnazione viene effettuata con una soluzione all'1% di nitrato d'argento con

Soluzione di piridina al 10%. I pezzi vengono conservati in questa miscela (in un barattolo scuro con tappo smerigliato) per 2-3 ore a temperatura ambiente, quindi 4-6 ore a temperatura ambiente.

50 °C nel termostato. Quindi i preparati vengono lavati rapidamente in una soluzione di piridina al 10%, dopo di che l'argento viene ridotto per diverse ore con acido pirrogalico al 4% con l'aggiunta di acetone purificato al 10% e

Soluzione di piridina al 15%.

Il metodo di Morozov è uno dei metodi più rapidi per argentare i treponemi pallidi, dando risultati abbastanza soddisfacenti [Ovchinnikov N.M. e così via.,

1987]. Per la colorazione con il metodo Morozov sono necessari i seguenti reagenti:

Reagente n. 1 - 1 ml di acido acetico glaciale, 2 ml di soluzione di formaldeide al 40% e 100 ml di acqua distillata;

Reagente n. 2 - 5 g di tannino, 100 ml di acido fenico liquido e 100 ml di acqua distillata;

Reagente n. 3 - soluzione di nitrato d'argento (5 g di nitrato d'argento cristallino vengono sciolti in 100 ml di acqua distillata; 20 ml di questa quantità vengono versati in un recipiente separato; una soluzione acquosa forte di ammoniaca viene aggiunta goccia a goccia ai restanti 80 ml di soluzione di nitrato d'argento fino a quando il precipitato giallo risultante, marrone e poi marrone-nero, non si scioglierà e rimarrà solo una leggera opalescenza; se l'aggiunta di ammoniaca non viene interrotta in tempo, questa soluzione viene aggiunta goccia a goccia dai restanti 20 ml di soluzione di nitrato d'argento fino alla comparsa di una leggera opalescenza), per la colorazione il reagente si diluisce con acqua distillata 1:10.

Impregnazione. La preparazione sottile viene essiccata all'aria, ma preferibilmente in un termostato. Il reagente viene versato sul preparato per 1 minuto.

N. 1, quindi il liquido viene scaricato, il preparato viene lavato con acqua. Incidere con il reagente n. 2 riscaldando fino alla comparsa del vapore (1 min). Sciacquare abbondantemente con acqua, versare il reagente n. 3, scaldare leggermente per 1–2 minuti finché il reagente diventa marrone scuro. La preparazione viene nuovamente lavata accuratamente con acqua ed asciugata. Microscopia con sistema a mersione.

Con questo metodo di impregnazione i treponemi risultano marroni o quasi neri, mantenendo le loro caratteristiche morfologiche.

I farmaci non possono essere conservati per lunghi periodi di tempo.

Colorazione secondo Romanovsky - Giemsa. Lo striscio viene fissato nella miscela di Nikiforov (etanolo ed etere in volumi uguali). Dopo che il liquido di fissaggio è evaporato dallo striscio, il preparato viene colorato con la vernice Romanovsky-Giemsa, diluita in ragione di 2 gocce di vernice per 1 ml di acqua distillata. Per fare questo, 10–15 ml di vernice diluita vengono versati in una capsula Petri, un vetrino viene abbassato su due bacchette di vetro, spalmato e il preparato viene lasciato colorare per 2–5 ore, a seconda dell'intensità della colorazione capacità della soluzione. Una volta completata la colorazione, il vetrino con lo striscio viene lavato accuratamente con un getto laterale di acqua. Asciugare la preparazione a temperatura ambiente. L'esame microscopico viene effettuato in un sistema ad immersione. Quando si colorano i preparati utilizzando il metodo Romanovsky-Giemsa, il treponema pallido acquisisce un colore rosa o rosa-violetto, mentre altri treponemi sono colorati con intensi toni bluastri.

Treponema pallidum è un batterio del genere Treponema che causa la sifilide, una malattia infettiva. La sua lunghezza varia da 8 a 20 micron, larghezza - da 0,25 a 0,35 micron. Ha la forma di una spirale e ricorda un cavatappi con un numero di riccioli di 8-12 pezzi. Questo tipo di struttura è chiamata spirocheta, motivo per cui questo batterio è noto anche come spirocheta pallidum.

Il corpo lungo e sottile consente al microbo di penetrare facilmente nel corpo umano attraverso le mucose. L'infezione avviene principalmente attraverso i genitali.

Cos'è Treponema

Il Treponema pallidum fu scoperto nel 1905 dagli scienziati tedeschi Hoffmann e Schaudin. Quando si esamina Treponema pallidum (nome latino, scritto anche T. pallidum) non viene rilevato dalla colorazione di Gram, quindi al batterio viene data la definizione di "pallido" (latino pallidum). Ha 4 sottospecie, ognuna delle quali rappresenta una minaccia per la salute umana:

Il Treponema pallidum ha un corpo ricoperto da una capsula mucosa priva di struttura, una parete cellulare a tre strati, organelli (vacuoli, ribosomi, mesosomi) e citoplasma. Le sue estremità sono solitamente appuntite, hanno escrescenze chiamate blefaroplasti, sulle quali sono presenti circa 10 fibrille (strutture filiformi) sotto forma di fasci. Grazie alle contrazioni cellulari e alle fibrille esistenti, la spirocheta pallida si muove rapidamente. Nel percorso verso il suo obiettivo, esegue vari movimenti: flessione, traslazione, rotazione, elicoidale, ecc.

In condizioni sfavorevoli, le forme del treponema pallidum cambiano, assume l'aspetto di cisti e la forma a L:

1. Nella forma a L, i treponemi diventano sferici, la loro riproduzione si interrompe e la parete cellulare si assottiglia, ma la crescita e la sintesi del DNA continuano.
2. Le cisti sono ricoperte da una membrana protettiva e possono rimanere latenti nel corpo umano per lungo tempo. Quando le condizioni cambiano in condizioni favorevoli, le cisti diventano grani e poi assumono la loro forma abituale.

Treponema pallidum è sensibile alle radiazioni ultraviolette e ha paura degli alcali, dell'aceto e dell'alcol. È resistente alle basse temperature (resiste al gelo fino a 1 anno), ma se riscaldato oltre i 50 °C muore entro 15-20 minuti. Fuori dal corpo umano non può vivere più di 3 giorni. È un anaerobio stretto, cioè non necessita di ossigeno libero per il metabolismo energetico. La resistenza delle cisti e delle forme L è molte volte più forte.

Segni di sifilide

Entrato nel corpo umano attraverso la mucosa, il batterio continua a muoversi attraverso i vasi linfatici e sanguigni, quindi si deposita nei tessuti. I primi segni di infezione compaiono solitamente 20-30 giorni dopo l'ingresso del microbo nell'organismo, ma a volte ciò non avviene prima di 3-4 mesi. Esistono diverse fasi della malattia: sifilide primaria, secondaria, ecc. Ciascuna di esse presenta sintomi caratteristici.

La sifilide primaria è lo stadio che si verifica immediatamente dopo l'infezione, i sintomi diventano evidenti dopo 10-90 giorni. Il paziente può avvertire debolezza, mal di testa, dolore alle ossa e ai muscoli e febbre. A volte non c'è alcun deterioramento della salute. I linfonodi spesso si ingrossano. Nel sito di penetrazione della spirocheta bianca si forma un sifiloma o un piccolo nodo denso con un diametro fino a 1 cm, che si trasforma gradualmente in un'ulcera.

Il Chancre può essere singolo o nella quantità di più pezzi e si verifica non solo sulle mucose, ma anche sulla pelle delle braccia, delle cosce, dell'addome, ecc. I Chancre hanno varietà chiamate anormali, la loro presenza è spesso confusa quando si fa una diagnosi :

Lo stadio secondario inizia 3 mesi dopo che l'agente patogeno della sifilide è entrato nel corpo. La sua durata può raggiungere i 5 anni. Periodicamente si verificano eruzioni cutanee (sifilide cutanea), che scompaiono da sole dopo alcune settimane. Possono avere aspetti diversi: macchie bianche sul collo (““), ulcere, macchie rosa pallido sui fianchi, ecc. Non si avverte prurito né febbre. A volte si osserva calvizie localizzata. La sifilide può colpire la mucosa della gola sotto forma di mal di gola e faringite.

La sifilide terziaria si manifesta diversi anni dopo l'infezione. Gli organi interni vengono distrutti e sulla pelle e sulle mucose compaiono caratteristiche sifilidi. La mucosa e gli organi interni sono colpiti da gengive, tumori che portano al decadimento irreversibile dei tessuti. Sulla pelle compaiono sifilidi tuberose e gommose (vedi foto).

Individuazione e trattamento della malattia

Per diagnosticare la sifilide, viene effettuato un esame completo. Innanzitutto, il paziente viene esaminato da un dermatovenerologo per la presenza di eruzioni cutanee sulla pelle e sulle mucose. Successivamente vengono effettuati esami di laboratorio su materiale prelevato dalle ulcere e dalle formazioni del paziente. Tali studi possono essere effettuati;

1. Test sierologici treponemici: RITB, RIF, TPHA, ELISA, immunoblotting. Permettono di rilevare gli anticorpi contro il Treponoma pallidum.
2. Test sierologici non treponemici: reazione di Wasserman, test quantitativo
   VDRL, test rapido delle reagine plasmatiche. Viene determinata la presenza di anticorpi contro i fosfolipidi tissutali.
3. Rilevazione del treponema nelle lesioni: PCR, RIF-Tr, microscopia a campo scuro.

È importante studiare attentamente tutti i segni per capire di cosa si tratta, perché i sintomi della sifilide coincidono con i sintomi di molte altre malattie. Se la diagnosi è confermata, viene prescritto un trattamento, il cui tipo dipende dallo stadio della malattia.

La terapia si basa sull'assunzione di antibiotici. La base dei farmaci è solitamente la penicillina, la tetraciclina o l'eritromicina. Se il paziente ha uno stadio terziario, vengono utilizzati prodotti a base di bismuto, che sono altamente tossici. Si può anche praticare la somministrazione intramuscolare di farmaci antibatterici e la piroterapia.

La disinfezione degli articoli domestici è obbligatoria e aiuta a uccidere l'agente patogeno all'esterno del corpo infetto. Inoltre, è necessario diagnosticare e trattare il partner sessuale.