Tra i ceppi di escherichia coli ci sono quelli patogeni. Caratteristiche biologiche dell'Escherichia coli. Ceppi di Escherichia coli: probiotici e componenti farmaceutici

L'invenzione riguarda la biotecnologia e riguarda la produzione di produttori di preparati probiotici - preparati batterici basati su colture vive di microrganismi simbionti utilizzati per la prevenzione e il trattamento della disbatteriosi e di altri disturbi del tratto gastrointestinale. Al ceppo M17 di Escherichia coli, produttore del farmaco probiotico colibatterina, è stato introdotto un plasmide non coniugativo e non mobilizzabile p Colap, contenente geni per la produzione di colicina E1 e determinanti della resistenza all'ampicillina in dosi fino a 150 mg /l. Il ceppo risultante è privo di un fenotipo adesivo indesiderato inattivando il gene dell'adesina fimH pili tipo 1 integrando il gene della resistenza alla kanamicina - neomicina npt. Il ceppo di E. coli M17 fim H::Kan/p Colap è stato depositato nel VKPM con il numero B-7448. Ciò consente di creare un preparato probiotico con una ridotta capacità di colonizzare nicchie diverse da quella intestinale, con aumento dell'attività antagonista e residente durante la terapia antibiotica. I tratti introdotti nel ceppo costruito sono stabilmente preservati nella popolazione. Ciò facilita la produzione di un farmaco standard basato sul ceppo e garantisce che l'eliminazione del plasmide non avvenga quando un paziente assume il farmaco senza una concomitante terapia antibiotica. 4 illustrazioni, 1 tab.

Nella fig. La Figura 1 mostra uno schema per ottenere un ceppo ricombinante di E. coli M17fimH::kan/pColap con un difetto nel gene di adesione pili fimH di tipo 1,

Nella fig. 2 - schema della costruzione del plasmide ibrido pColap,

Nella fig. La Figura 3 mostra i risultati di uno studio sull'attività adesiva del ceppo di Escherichia coli costruito M17 fimH::kan/pColap,

Nella fig. 4 - risultati di uno studio di stabilità del ceppo costruito di Escherichia coli M17 fimH::kan/pColap. Quando si è ottenuto il ceppo di E. coli M17 fimH::kan/pColap, il suo analogo più vicino, il ceppo di E. coli M17, è stato utilizzato come punto di partenza. Per eliminare l'adesina fimbriale, che conferisce un fenotipo Mn altamente adesivo indesiderato alle cellule M17 di E. coli, è stato ottenuto un ceppo ricombinante in cui il gene di resistenza alla kanamicina-neomicina npt è stato integrato nel gene cromosomico fimH che codifica l'adesina. A questo scopo abbiamo utilizzato il plasmide pCH103, un derivato del plasmide R6K, che ha un sistema di replicazione pir-dipendente e può essere mantenuto solo in ceppi contenenti il gene pir, che ne garantisce la replicazione [Sokurenko E.V., Chesnokova V.L. "Un metodo per modificare il fenotipo adesivo degli isolati selvatici di E. coli applicato ai ceppi che producono il farmaco colibacterin." Bollettino di Biologia e Medicina Sperimentale, 1997, Volume 124, N. 9, p. 334 - 338]. Il plasmide pCH103 trasporta il gene di resistenza all'ampicillina e un frammento cromosomico contenente i geni del cluster fim, in cui l'integrità del gene fimH viene interrotta dall'inserimento del gene di resistenza alla kanamicina (neomicina) npt. Dopo la sua trasformazione nel ceppo di E. coli M17, non può essere mantenuto nelle cellule e possono formarsi trasformanti resistenti alla kanamicina quando è completamente integrato nel cromosoma come risultato di un singolo incrocio o come risultato di un doppio incrocio sopra (Fig. 1). I trasformanti della seconda classe rimangono sensibili all'ampicillina. Tra questi, è stato selezionato un ceppo denominato E. coli M17fimH::kan (o M17 fimH::npt). Lo studio ha confermato l'assenza di adesione sensibile al mannosio nel ceppo risultante, vale a dire FimH - fenotipo. Per aumentare l'attività antagonista del ceppo di E. coli M17 e conferirgli resistenza all'ampicillina basata sul plasmide ColE1 utilizzando metodi noti ["Metodi di genetica molecolare e ingegneria genetica", 1990, Novosibirsk, "Nauka", Siberian Branch, p. 7-10, 39-44] è stato costruito un plasmide ibrido pColap (Fig. 1). Il plasmide ColE1 originale, isolato da un ceppo di E. coli non patogeno, è stato studiato in dettaglio. Ha una gamma piuttosto ristretta di ospiti (principalmente ceppi di E. coli) ed è mantenuto stabilmente nelle cellule batteriche. Si conosce la sua sequenza nucleotidica completa, le funzioni di tutti i suoi elementi genetici e la regolazione della loro attività. Il plasmide determina la sintesi della colicina E1, che ha un effetto dannoso sulle cellule dei batteri correlati. Lo svantaggio del plasmide ColE1 è la sua capacità di essere mobilizzato in altre cellule utilizzando plasmidi coniugativi, dovuta alla presenza della regione mob nella sua struttura. Utilizzando l'endonucleasi di restrizione BspLu11.1, questa regione è stata completamente rimossa e altri elementi genetici del plasmide non sono stati praticamente influenzati. Quindi, utilizzando l'endonucleasi di restrizione BspH1, un frammento contenente il gene b1a che codifica per la sintesi della lattamasi è stato tagliato dal noto vettore pUC19 e legato con un frammento del plasmide ColE1 privo della regione mob. Come risultato è stato ottenuto il plasmide pColap. Questo plasmide non è coniugativo e non mobilizzabile e quindi praticamente non può essere trasferito nelle cellule di altri batteri. A differenza del vettore pUC19 e di altri plasmidi, pColap fornisce solo un moderato livello di resistenza all'ampicillina ai ceppi di E. coli da esso trasformati (Tabella 1). Questo deterioramento nell'espressione del gene della lattamasi è osservato a causa di disturbi nella regione del promotore del gene (Hilbert box) e nella regione 5" che aumenta l'efficienza dell'espressione, verificatisi a seguito di manipolazioni genetiche durante la costruzione del gene della lattamasi plasmide ricombinante pColap. La sensibilità dei ceppi portatori di pColap ad elevate concentrazioni di antibiotico deve essere considerata un fattore favorevole, quindi se per qualche motivo la presenza di ceppi contenenti questo plasmide nell'intestino del paziente diventa indesiderabile, o se, a seguito di qualche evento eccezionale , il plasmide viene trasferito ad un altro ceppo, quindi tutte le cellule che lo contengono possono essere eliminate dall'organismo utilizzando antibiotici β-lattamici ad alte concentrazioni. Il ceppo di E. coli M17 fimH::kan è stato trasformato con il plasmide pColap e il ceppo di E. coli È stato ottenuto il ceppo M17 fimH::kan/pColap. Il ceppo ha le seguenti caratteristiche: Morfologia: bastoncini sottili Gram-negativi, debolmente mobili, con estremità arrotondate di 1,5 - 2 micron di lunghezza. Caratteristiche culturali e fisiologiche. Agar peptone di carne e brodo di agar Hotinger. Dopo 36 ore di crescita a 37°C forma colonie rotonde biancastre traslucide con diametro di 1,5 - 2,5 mm, la superficie delle colonie è liscia, i bordi sono regolari, la struttura è omogenea, la consistenza è pastosa, sono facilmente emulsionabile. Agar terreno minimo M9 con glucosio (0,2%). Dopo 40 ore di crescita forma colonie di 1-2 mm di diametro, grigio-biancastre, traslucide, rotonde, convesse, con bordi lisci. Brodo di carne-peptone e brodo Hotinger. Dopo 18-24 ore di crescita a 37°C si osserva una forte torbidità uniforme, un leggero sedimento ed un odore caratteristico. Terreno minimo liquido M9 con glucosio (0,2%). Dopo 20-24 ore di crescita con aerazione si osserva una forte torbidità uniforme, l'odore è debole o assente. Crescita mediante iniezione in agar carne-peptone. Buona crescita durante tutta l'iniezione. Il microrganismo è un anaerobio facoltativo. Relazione con la temperatura e il pH dell'ambiente. Cresce bene a temperature da 30 a 42 o C e pH 6,8 - 7,2. Proprietà biochimiche. Ben assimila glucosio, saccarosio, lattosio, fruttosio, mannosio, xilosio, mannitolo e sorbitolo con formazione di acido e gas. Ramnosio, galattosio e arabinosio - con debole formazione di acido; salicina - con formazione ritardata di acido e gas; raffinosio - solo con formazione di acido. L'inositolo non viene assorbito. Non forma idrogeno solforato; produce indolo. Atteggiamento verso gli antibiotici. Resistente all'ampicillina a concentrazioni nel mezzo fino a 150 mg/l. Produzione di batteriocine. Produce la colicina E1. Contenuto dei plasmidi. Le cellule contengono un plasmide multicopia non coniugativo e non mobilizzabile pColap (5239 bp), che determina la resistenza all'ampicillina e alla sintesi della colicina E1. Il ceppo ha una formula antigenica O2:L1:H6 ed è agglutinato dal siero con un titolo sierico di almeno 1:64000. L'invenzione è illustrata da esempi che caratterizzano la resistenza di ceppi portatori di vari plasmidi all'ampicillina e la stabilità delle loro caratteristiche durante la coltivazione. Esempio 1. Studio della crescita del ceppo di E. coli M17 e dei suoi derivati contenenti plasmidi su terreni con diverse concentrazioni di ampicillina (Tabella 1). I ceppi di E. coli studiati (Tabella 1) sono stati coltivati per 18 ore in brodo Luria (LB - 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl per 1 litro di acqua distillata) a 37 o C con aerazione. Successivamente sono state preparate diluizioni seriali di colture batteriche a 10 -7 in soluzione fisiologica e ciascuna coltura è stata seminata su piastre con LA (LB + 1,6% agar) contenente ampicillina nelle seguenti concentrazioni (μg/ml): 5, 50, 75, 100 , 125, 150, 200, 250. La crescita della colonia è stata valutata dopo 18-24 ore. I risultati sono presentati nella Tabella 1. Come si può vedere dalla Tabella 1, il ceppo originale di Escherichia coli M17 mostra un'elevata sensibilità all'ampicillina. Il plasmide pUC19 contenuto nel ceppo M17/pUC19, che era la fonte del gene della lattamasi per il plasmide pColap che abbiamo costruito, conferisce alla cellula batterica resistenza a concentrazioni di ampicillina fino a 2 g/l. Allo stesso tempo, il plasmide pColap contenuto nel ceppo M17 fimH::kan/pColap fornisce resistenza a concentrazioni di ampicillina non superiori a 150 mg/l. Pertanto, i ceppi risultanti hanno un livello moderato di resistenza all’ampicillina. Esempio 2. Studio delle proprietà adesive e determinazione del fenotipo adesivo del ceppo E. coli M17 e suoi derivati. Il fenotipo adesivo è stato determinato mediante il metodo standard dello "studio della crescita". Da una coltura fresca dei ceppi batterici studiati è stata preparata una sospensione di cellule batteriche in soluzione fisiologica con una densità ottica di 1,0 ad una lunghezza d'onda di 540 nm. Parallelamente, sono state preparate piastre per microtitolazione con pozzetti a fondo piatto con substrati di adesione immobilizzati nei pozzetti, vale a dire MN (mannano di lievito), RN (RNasi B bovina) e BSA (albumina sierica bovina). La sospensione batterica è stata quindi posta nei pozzetti e incubata per 40 minuti. Le cellule batteriche non legate sono state lavate accuratamente con soluzione salina. Un ricco mezzo nutriente è stato aggiunto ai pozzetti e incubato con agitazione costante a 37°C per 2,5 - 3 ore fino alla comparsa di torbidità nei pozzetti. La densità ottica in ciascun pozzetto è stata registrata utilizzando un lettore automatico di micropiastre (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, California, USA). In questo esperimento sono stati studiati i seguenti ceppi di E. coli: M17 - ceppo originale; M17 fimH::kan - ceppo M17 con un gene dell'adesina fimH inattivato: M17 fimH: : kan/pPKL91 - ceppo fimH::kan, trasformato con il plasmide pPKL91 contenente il gene regolatore fimB, inclusa l'espressione dei pili di tipo 1 da parte di una cellula batterica ; ceppo M17fimH::kan/pColap - ceppo M17 fimH::kan, trasformato con il plasmide pColap da noi costruito, portante determinanti della resistenza all'ampicillina e della produzione di colicina E1. I risultati di uno studio sull'attività adesiva dei ceppi di E. coli M17 e dei derivati del ceppo di E. coli M17, valutati utilizzando il metodo dello "studio della crescita", sono presentati in Fig. 3 (in ordinata sono riportati i valori di densità ottica alla lunghezza d'onda di 540 nm; in ascissa sono riportati i ceppi di E. coli studiati: 1 - M17; 2 - M17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - M17 fimH ::kan/pColap). Come si può vedere dalla figura. 3, il ceppo originale di E. coli M17 si lega bene sia alla RNasi B che al mannano, il che indica un fenotipo adesivo MN, indesiderabile per il ceppo intestinale di Escherichia coli. Il ceppo ricombinante M17 fimH::kan che abbiamo ottenuto mostra attività adesiva pari a zero sia da solo che dopo l'introduzione in esso di un plasmide che include l'espressione dei pili di tipo 1. L'attività adesiva nulla rimane in questo ceppo anche dopo l'introduzione del plasmide pColap (ceppo M17 fimH::kan/pColap). Esempio 3. Studio della stabilità dei tratti del ceppo di Escherichia coli M17 fimH::kan/pColap, determinati dal plasmide pColap. Il plasmide pColap che abbiamo costruito garantisce la produzione di colicina E1 e resistenza all'ampicillina. La conservazione di queste caratteristiche dipende dalla stabilità del mantenimento del plasmide nelle cellule batteriche: la perdita del plasmide si accompagna alla perdita delle caratteristiche corrispondenti. La stabilità nel mantenimento della resistenza all'ampicillina e la colicinogenicità dei ceppi risultanti è stata determinata quando sono stati coltivati in un mezzo nutriente liquido in assenza di un agente selettivo per 100 generazioni. Il plasmide originale ColE1 è stato utilizzato come controllo positivo e il plasmide pBR322, un derivato ColE1 che non contiene il cer locus, che influisce sulla stabilità dei plasmidi, è stato utilizzato come controllo negativo. Le colture dei ceppi M17 fimH::kan/pColap, M17/ColE1 e M17/pBR322 sono state coltivate per 18 ore con maggiore aerazione a 37 oC in LB con ampicillina (100 μg/ml). Il ceppo M17/ColE1 è stato coltivato nelle stesse condizioni, ma senza ampicillina. Le colture risultanti contenevano circa 10 o cellule batteriche per ml. Quindi 10 µl (10 6) della corrispondente coltura batterica sono stati aggiunti a provette con 10 ml di LB (senza aggiunta di antibiotico). La sospensione risultante è stata coltivata come descritto sopra. Con questa coltivazione le cellule batteriche sono riuscite a subire 10 divisioni. Ripetendo questa operazione 10 volte, abbiamo ottenuto una coltura batterica che aveva attraversato 100 generazioni dal primo inoculo in un terreno privo di agente selettivo. Prima di ogni inoculazione, sono stati prelevati campioni di colture batteriche e testati per la resistenza all'ampicillina e la produzione di colicina. Per fare ciò, le sospensioni cellulari sono state piastrate su piastre LA fino all'ottenimento delle singole colonie. Quindi, 100 colonie di ciascun ceppo sono state testate per verificarne la capacità di crescere sullo stesso terreno in presenza di ampicillina (100 μg/ml). Inoltre, è stata testata la capacità delle colonie di produrre colicina E1. A tale scopo è stato utilizzato un test con l'applicazione di top agar (Miller J. "Experiments in molecolare genetics", M., "Mir", 1976, pp. 183-189). Il test è il seguente: le colonie test vengono seminate su piastre con un terreno nutritivo solido contenente l'1,6% di agar utilizzando un replicatore o uno stuzzicadenti. Le piastre vengono incubate a 37 oC per 3-4 ore, la produzione di colicina viene indotta mediante irradiazione ultravioletta per 4-5 secondi e incubate nelle stesse condizioni durante la notte. Le cellule vengono quindi lisate con vapore di cloroformio a temperatura ambiente per 30-40 minuti. È importante assicurarsi che nella fase successiva tutto il cloroformio sia evaporato dalla tazza. Strato 3 - 5 ml di agar semiliquido (0,7%) contenente 10 7 /ml di cellule batteriche del ceppo di prova E. coli (sensibile alla colicina E1) sullo strato inferiore dell'agar. Incubare per una notte a 37 o C. Viene registrata la presenza di zone schiarite nello strato di coltura in esame attorno alle macchie dei ceppi studiati. I risultati dello studio della stabilità del ceppo di Escherichia coli costruito M17/pColap sono mostrati in Fig. 2 (ColE1 corrisponde al ceppo M17/ColE1, pBR322 al ceppo M17/pBR322, pColap al ceppo M17/pColap). La presenza di un plasmide in una cellula batterica deriva dalla conservazione delle sue proprietà originali (colicinogenicità e/o resistenza all'ampicillina). I risultati dell’esperimento (Fig. 2) indicano che il plasmide pBR322, privo del cer locus, viene rapidamente eliminato dalla popolazione batterica se coltivato in un ambiente privo di antibiotici, mentre gli altri due plasmidi (l’originale ColE1 e il ricombinante pColap ) vengono ereditati stabilmente dalle cellule in queste condizioni. Questa proprietà è uno degli importanti vantaggi del nostro progetto poiché, da un lato, facilita la preparazione di un farmaco standard a base di un ceppo contenente pColap e, dall'altro, garantisce che quando il farmaco viene assunto da un paziente senza concomitante terapia antibiotica, il plasmide non verrà eliminato. Applicabilità industriale. La descrizione fornita del metodo per costruire il ceppo brevettato di Escherichia coli M17 rimH::kan/pColap è sufficiente per ottenere nuovamente il ceppo utilizzando metodi, reagenti e apparecchiature standard utilizzati nella ricerca di ingegneria genetica.

RECLAMO

Ceppo batterico di Escherichia coli M 17 fim H::kan/p Colap VKPM B-7448, utilizzato per ottenere un preparato probiotico.

La presente invenzione riguarda il settore delle biotecnologie e riguarda la creazione di un ceppo migliorato di Escherichia coli, utilizzabile per ottenere probiotici, preparati batterici a base di colture vive di microrganismi simbionti. I probiotici (altri nomi per i farmaci di questo gruppo: flora normale, eubiotici, microbiotici) sono un mezzo efficace per la prevenzione e il trattamento della disbiosi intestinale. La disbatteriosi è un cambiamento pronunciato nelle specie e nel rapporto quantitativo dei microbi, che si manifesta nel rapido sviluppo di microrganismi opportunistici, in particolare batteri del gruppo intestinale (Enterobacteriaceae), ed è accompagnato da varie manifestazioni dolorose. Una causa importante di disbiosi è l'uso di antibiotici e altri farmaci antimicrobici [Krasnogolovets V.N. "Significato clinico della disbiosi intestinale che si è sviluppata a seguito dell'uso di antibiotici". Nel libro. "L'uso del colibacterin per la prevenzione e il trattamento delle malattie intestinali e la tecnologia della sua produzione." M., 1967, pag. 223 - 243]. Attualmente in Russia sono noti i preparati probiotici “Colibacterin” e “Bifikol”, ottenuti sulla base del ceppo di Escherichia coli M17, che è essenzialmente un derivato del ceppo di E. coli isolato da A. Nissle e utilizzato per ottenere il farmaco “Mutaflor” (Germania) [Peretz L.G. "Colibacterin secco. Nuovi metodi di diagnosi, cura e prevenzione delle malattie intestinali." Nel libro. "Tesi di relazione al Plenum del Consiglio medico accademico del Ministero della sanità della RSFSR." M., 1961, pag. 52-54]. Tuttavia, a differenza del ceppo originale, il ceppo di E. coli M17 ha perso la capacità di sintetizzare la colicina B e, quindi, ha ridotto la sua attività antagonista nei confronti dei batteri intestinali [Shemchuk L.F. "Standardizzazione dei colibatteri", abstract. Candidato di Scienze Biologiche, M., 1983, p. 16]. Un altro svantaggio del ceppo di E. coli M17 e del suo predecessore è la presenza di un fenotipo di fimbrie Mn di tipo 1 altamente adesivo, che è insolito e indesiderabile per un ceppo intestinale. Questo fenotipo si trova spesso in ceppi isolati dal macroorganismo durante infezioni del tratto urinario e polmonite acquisita in ospedale [Sokurenko E.V., Chesnokova V.L. "Un metodo per modificare il fenotipo adesivo degli isolati selvatici di E. coli applicato ai ceppi che producono il farmaco colibacterin." Bollettino di Biologia e Medicina Sperimentale, 1997, Volume 124, N. 9, p. 334 - 338]. Uno svantaggio del ceppo E. coli M17 è anche la sua sensibilità agli antibiotici. Pertanto, i farmaci basati su di esso non possono essere efficaci durante l'assunzione di antibiotici. Nel frattempo, l’uso simultaneo di antibiotici e probiotici può prevenire lo sviluppo della disbiosi e quindi aumentare l’efficacia delle misure terapeutiche e ridurre i tempi di trattamento. L'obiettivo dell'invenzione è quello di creare un ceppo di E. coli - un derivato di E. coli M17, che elimini gli svantaggi sopra menzionati del noto ceppo di E. coli M17, vale a dire: attività antagonista ridotta, fenotipo adesivo indesiderato, sensibilità a antibiotici. Il risultato tecnico consiste nella costruzione di un ceppo con aumentata attività antagonista, ridotta capacità di colonizzare nicchie diverse da quella intestinale primaria nel macroorganismo e resistenza a dosi moderate di antibiotici penicillinici. Questo obiettivo viene raggiunto utilizzando metodi genetici e di ingegneria genetica per costruire il ceppo di E. coli M17 fimH::kan/pColap, che produce colicina E1, è resistente a concentrazioni moderate di ampicillina (fino a 150 U/ml) e contiene un agente inattivato gene fimH, che codifica per l'adesione fimbriale. Il ceppo di E. coli M17 fimH::kan/pColap è stato depositato nella Collezione panrussa di microrganismi industriali con il numero di registrazione B-7448. Il design brevettato del ceppo si basa sulle seguenti disposizioni. Abbiamo dimostrato per la prima volta che l'inattivazione del gene dell'adesina fimH pili tipo 1 nel genoma del ceppo di Escherichia coli M17 e l'introduzione nel ceppo di Escherichia coli M17 del plasmide non coniugativo e non mobilizzabile pColap, contenente i geni per la produzione di colicina E1 e determinanti di resistenza all'ampicillina in dosi fino a 150 mg/l permette di realizzare un preparato probiotico con ridotta capacità di colonizzare nicchie diverse da quella intestinale, con aumentata attività antagonista e residente durante la terapia antibiotica . L'essenza della soluzione brevettata di ingegneria genetica è illustrata dai disegni, dove: FIG. La Figura 1 mostra uno schema per ottenere un ceppo ricombinante di E. coli M17fimH::kan/pColap con un difetto nel gene di adesione pili fimH di tipo 1; 2 - schema di costruzione del plasmide ibrido pColap, FIG. La Figura 3 mostra i risultati di uno studio sull'attività adesiva del ceppo costruito di Escherichia coli M17 fimH::kan/pColap, Fig. 4 - risultati di uno studio di stabilità del ceppo costruito di Escherichia coli M17 fimH::kan/pColap. Quando si è ottenuto il ceppo di E. coli M17 fimH::kan/pColap, il suo analogo più vicino, il ceppo di E. coli M17, è stato utilizzato come punto di partenza. Per eliminare l'adesina fimbriale, che conferisce un fenotipo Mn altamente adesivo indesiderato alle cellule M17 di E. coli, è stato ottenuto un ceppo ricombinante in cui il gene di resistenza alla kanamicina-neomicina npt è stato integrato nel gene cromosomico fimH che codifica l'adesina. A questo scopo abbiamo utilizzato il plasmide pCH103, un derivato del plasmide R6K, che ha un sistema di replicazione pir-dipendente e può essere mantenuto solo in ceppi contenenti il gene pir, che ne garantisce la replicazione [Sokurenko E.V., Chesnokova V.L. "Un metodo per modificare il fenotipo adesivo degli isolati selvatici di E. coli applicato ai ceppi che producono il farmaco colibacterin." Bollettino di Biologia e Medicina Sperimentale, 1997, Volume 124, N. 9, p. 334 - 338]. Il plasmide pCH103 trasporta il gene di resistenza all'ampicillina e un frammento cromosomico contenente i geni del cluster fim, in cui l'integrità del gene fimH viene interrotta dall'inserimento del gene di resistenza alla kanamicina (neomicina) npt. Dopo la sua trasformazione nel ceppo di E. coli M17, non può essere mantenuto nelle cellule e possono formarsi trasformanti resistenti alla kanamicina quando è completamente integrato nel cromosoma come risultato di un singolo incrocio o come risultato di un doppio incrocio sopra (Fig. 1). I trasformanti della seconda classe rimangono sensibili all'ampicillina. Tra questi, è stato selezionato un ceppo denominato E. coli M17fimH::kan (o M17 fimH::npt). Lo studio ha confermato l'assenza di adesione sensibile al mannosio nel ceppo risultante, vale a dire FimH - fenotipo. Per aumentare l'attività antagonista del ceppo di E. coli M17 e conferirgli resistenza all'ampicillina basata sul plasmide ColE1 utilizzando metodi noti ["Metodi di genetica molecolare e ingegneria genetica", 1990, Novosibirsk, "Nauka", Siberian Branch, p. 7-10, 39-44] è stato costruito un plasmide ibrido pColap (Fig. 1). Il plasmide ColE1 originale, isolato da un ceppo di E. coli non patogeno, è stato studiato in dettaglio. Ha una gamma piuttosto ristretta di ospiti (principalmente ceppi di E. coli) ed è mantenuto stabilmente nelle cellule batteriche. Si conosce la sua sequenza nucleotidica completa, le funzioni di tutti i suoi elementi genetici e la regolazione della loro attività. Il plasmide determina la sintesi della colicina E1, che ha un effetto dannoso sulle cellule dei batteri correlati. Lo svantaggio del plasmide ColE1 è la sua capacità di essere mobilizzato in altre cellule utilizzando plasmidi coniugativi, dovuta alla presenza della regione mob nella sua struttura. Utilizzando l'endonucleasi di restrizione BspLu11.1, questa regione è stata completamente rimossa e altri elementi genetici del plasmide non sono stati praticamente influenzati. Quindi, utilizzando l'endonucleasi di restrizione BspH1, un frammento contenente il gene b1a che codifica per la sintesi della lattamasi è stato tagliato dal noto vettore pUC19 e legato con un frammento del plasmide ColE1 privo della regione mob. Come risultato è stato ottenuto il plasmide pColap. Questo plasmide non è coniugativo e non mobilizzabile e quindi praticamente non può essere trasferito nelle cellule di altri batteri. A differenza del vettore pUC19 e di altri plasmidi, pColap fornisce solo un moderato livello di resistenza all'ampicillina ai ceppi di E. coli da esso trasformati (Tabella 1). Questo deterioramento nell'espressione del gene della lattamasi è osservato a causa di disturbi nella regione del promotore del gene (Hilbert box) e nella regione 5" che aumenta l'efficienza dell'espressione, verificatisi a seguito di manipolazioni genetiche durante la costruzione del gene della lattamasi plasmide ricombinante pColap. La sensibilità dei ceppi portatori di pColap ad elevate concentrazioni di antibiotico deve essere considerata un fattore favorevole, quindi se per qualche motivo la presenza di ceppi contenenti questo plasmide nell'intestino del paziente diventa indesiderabile, o se, a seguito di qualche evento eccezionale , il plasmide viene trasferito ad un altro ceppo, quindi tutte le cellule che lo contengono possono essere eliminate dall'organismo utilizzando antibiotici β-lattamici ad alte concentrazioni. Il ceppo di E. coli M17 fimH::kan è stato trasformato con il plasmide pColap e il ceppo di E. coli È stato ottenuto il ceppo M17 fimH::kan/pColap. Il ceppo ha le seguenti caratteristiche: Morfologia: bastoncini sottili Gram-negativi, debolmente mobili, con estremità arrotondate di 1,5 - 2 micron di lunghezza. Caratteristiche culturali e fisiologiche. Agar peptone di carne e brodo di agar Hotinger. Dopo 36 ore di crescita a 37°C forma colonie rotonde biancastre traslucide con diametro di 1,5 - 2,5 mm, la superficie delle colonie è liscia, i bordi sono regolari, la struttura è omogenea, la consistenza è pastosa, sono facilmente emulsionabile. Agar terreno minimo M9 con glucosio (0,2%). Dopo 40 ore di crescita forma colonie di 1-2 mm di diametro, grigio-biancastre, traslucide, rotonde, convesse, con bordi lisci. Brodo di carne-peptone e brodo Hotinger. Dopo 18-24 ore di crescita a 37°C si osserva una forte torbidità uniforme, un leggero sedimento ed un odore caratteristico. Terreno minimo liquido M9 con glucosio (0,2%). Dopo 20-24 ore di crescita con aerazione si osserva una forte torbidità uniforme, l'odore è debole o assente. Crescita mediante iniezione in agar carne-peptone. Buona crescita durante tutta l'iniezione. Il microrganismo è un anaerobio facoltativo. Relazione con la temperatura e il pH dell'ambiente. Cresce bene a temperature da 30 a 42 o C e pH 6,8 - 7,2. Proprietà biochimiche. Ben assimila glucosio, saccarosio, lattosio, fruttosio, mannosio, xilosio, mannitolo e sorbitolo con formazione di acido e gas. Ramnosio, galattosio e arabinosio - con debole formazione di acido; salicina - con formazione ritardata di acido e gas; raffinosio - solo con formazione di acido. L'inositolo non viene assorbito. Non forma idrogeno solforato; produce indolo. Atteggiamento verso gli antibiotici. Resistente all'ampicillina a concentrazioni nel mezzo fino a 150 mg/l. Produzione di batteriocine. Produce la colicina E1. Contenuto dei plasmidi. Le cellule contengono un plasmide multicopia non coniugativo e non mobilizzabile pColap (5239 bp), che determina la resistenza all'ampicillina e alla sintesi della colicina E1. Il ceppo ha una formula antigenica O2:L1:H6 ed è agglutinato dal siero con un titolo sierico di almeno 1:64000. L'invenzione è illustrata da esempi che caratterizzano la resistenza di ceppi portatori di vari plasmidi all'ampicillina e la stabilità delle loro caratteristiche durante la coltivazione. Esempio 1. Studio della crescita del ceppo di E. coli M17 e dei suoi derivati contenenti plasmidi su terreni con diverse concentrazioni di ampicillina (Tabella 1). I ceppi di E. coli studiati (Tabella 1) sono stati coltivati per 18 ore in brodo Luria (LB - 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl per 1 litro di acqua distillata) a 37 o C con aerazione. Successivamente sono state preparate diluizioni seriali di colture batteriche a 10 -7 in soluzione fisiologica e ciascuna coltura è stata seminata su piastre con LA (LB + 1,6% agar) contenente ampicillina nelle seguenti concentrazioni (μg/ml): 5, 50, 75, 100 , 125, 150, 200, 250. La crescita della colonia è stata valutata dopo 18-24 ore. I risultati sono presentati nella Tabella 1. Come si può vedere dalla Tabella 1, il ceppo originale di Escherichia coli M17 mostra un'elevata sensibilità all'ampicillina. Il plasmide pUC19 contenuto nel ceppo M17/pUC19, che era la fonte del gene della lattamasi per il plasmide pColap che abbiamo costruito, conferisce alla cellula batterica resistenza a concentrazioni di ampicillina fino a 2 g/l. Allo stesso tempo, il plasmide pColap contenuto nel ceppo M17 fimH::kan/pColap fornisce resistenza a concentrazioni di ampicillina non superiori a 150 mg/l. Pertanto, i ceppi risultanti hanno un livello moderato di resistenza all’ampicillina. Esempio 2. Studio delle proprietà adesive e determinazione del fenotipo adesivo del ceppo M17 di E. coli e dei suoi derivati. Il fenotipo adesivo è stato determinato mediante il metodo standard dello "studio della crescita". Da una coltura fresca dei ceppi batterici studiati è stata preparata una sospensione di cellule batteriche in soluzione fisiologica con una densità ottica di 1,0 ad una lunghezza d'onda di 540 nm. Parallelamente, sono state preparate piastre per microtitolazione con pozzetti a fondo piatto con substrati di adesione immobilizzati nei pozzetti, vale a dire MN (mannano di lievito), RN (RNasi B bovina) e BSA (albumina sierica bovina). La sospensione batterica è stata quindi posta nei pozzetti e incubata per 40 minuti. Le cellule batteriche non legate sono state lavate accuratamente con soluzione salina. Un ricco mezzo nutriente è stato aggiunto ai pozzetti e incubato con agitazione costante a 37°C per 2,5 - 3 ore fino alla comparsa di torbidità nei pozzetti. La densità ottica in ciascun pozzetto è stata registrata utilizzando un lettore automatico di micropiastre (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, California, USA). In questo esperimento sono stati studiati i seguenti ceppi di E. coli: M17 - ceppo originale; M17 fimH::kan - ceppo M17 con un gene dell'adesina fimH inattivato: M17 fimH: : kan/pPKL91 - ceppo fimH::kan, trasformato con il plasmide pPKL91 contenente il gene regolatore fimB, inclusa l'espressione dei pili di tipo 1 da parte di una cellula batterica ; ceppo M17fimH::kan/pColap - ceppo M17 fimH::kan, trasformato con il plasmide pColap da noi costruito, portante determinanti della resistenza all'ampicillina e della produzione di colicina E1. I risultati di uno studio sull'attività adesiva dei ceppi di E. coli M17 e dei derivati del ceppo di E. coli M17, valutati utilizzando il metodo dello "studio della crescita", sono presentati in Fig. 3 (in ordinata sono riportati i valori di densità ottica alla lunghezza d'onda di 540 nm; in ascissa sono riportati i ceppi di E. coli studiati: 1 - M17; 2 - M17 fimH::kan, 3 - M17fimH::kan/pPKL91, 4 - M17 fimH ::kan/pColap). Come si può vedere dalla figura. 3, il ceppo originale di E. coli M17 si lega bene sia alla RNasi B che al mannano, il che indica un fenotipo adesivo MN, indesiderabile per il ceppo intestinale di Escherichia coli. Il ceppo ricombinante M17 fimH::kan che abbiamo ottenuto mostra attività adesiva pari a zero sia da solo che dopo l'introduzione in esso di un plasmide che include l'espressione dei pili di tipo 1. L'attività adesiva nulla rimane in questo ceppo anche dopo l'introduzione del plasmide pColap (ceppo M17 fimH::kan/pColap). Esempio 3. Studio della stabilità dei tratti del ceppo di Escherichia coli M17 fimH::kan/pColap, determinati dal plasmide pColap. Il plasmide pColap che abbiamo costruito garantisce la produzione di colicina E1 e resistenza all'ampicillina. La conservazione di queste caratteristiche dipende dalla stabilità del mantenimento del plasmide nelle cellule batteriche: la perdita del plasmide si accompagna alla perdita delle caratteristiche corrispondenti. La stabilità nel mantenimento della resistenza all'ampicillina e la colicinogenicità dei ceppi risultanti è stata determinata quando sono stati coltivati in un mezzo nutriente liquido in assenza di un agente selettivo per 100 generazioni. Il plasmide originale ColE1 è stato utilizzato come controllo positivo e il plasmide pBR322, un derivato ColE1 che non contiene il cer locus, che influisce sulla stabilità dei plasmidi, è stato utilizzato come controllo negativo. Le colture dei ceppi M17 fimH::kan/pColap, M17/ColE1 e M17/pBR322 sono state coltivate per 18 ore con maggiore aerazione a 37 oC in LB con ampicillina (100 μg/ml). Il ceppo M17/ColE1 è stato coltivato nelle stesse condizioni, ma senza ampicillina. Le colture risultanti contenevano circa 10 o cellule batteriche per ml. Quindi 10 µl (10 6) della corrispondente coltura batterica sono stati aggiunti a provette con 10 ml di LB (senza aggiunta di antibiotico). La sospensione risultante è stata coltivata come descritto sopra. Con questa coltivazione le cellule batteriche sono riuscite a subire 10 divisioni. Ripetendo questa operazione 10 volte, abbiamo ottenuto una coltura batterica che aveva attraversato 100 generazioni dal primo inoculo in un terreno privo di agente selettivo. Prima di ogni inoculazione, sono stati prelevati campioni di colture batteriche e testati per la resistenza all'ampicillina e la produzione di colicina. Per fare ciò, le sospensioni cellulari sono state piastrate su piastre LA fino all'ottenimento delle singole colonie. Quindi, 100 colonie di ciascun ceppo sono state testate per verificarne la capacità di crescere sullo stesso terreno in presenza di ampicillina (100 μg/ml). Inoltre, è stata testata la capacità delle colonie di produrre colicina E1. A tale scopo è stato utilizzato un test con l'applicazione di top agar (Miller J. "Experiments in molecolare genetics", M., "Mir", 1976, pp. 183-189). Il test è il seguente: le colonie test vengono seminate su piastre con un terreno nutritivo solido contenente l'1,6% di agar utilizzando un replicatore o uno stuzzicadenti. Le piastre vengono incubate a 37 oC per 3-4 ore, la produzione di colicina viene indotta mediante irradiazione ultravioletta per 4-5 secondi e incubate nelle stesse condizioni durante la notte. Le cellule vengono quindi lisate con vapore di cloroformio a temperatura ambiente per 30-40 minuti. È importante assicurarsi che nella fase successiva tutto il cloroformio sia evaporato dalla tazza. Strato 3 - 5 ml di agar semiliquido (0,7%) contenente 10 7 /ml di cellule batteriche del ceppo di prova E. coli (sensibile alla colicina E1) sullo strato inferiore dell'agar. Incubare per una notte a 37 o C. Viene registrata la presenza di zone schiarite nello strato di coltura in esame attorno alle macchie dei ceppi studiati. I risultati dello studio della stabilità del ceppo di Escherichia coli costruito M17/pColap sono mostrati in Fig. 2 (ColE1 corrisponde al ceppo M17/ColE1, pBR322 al ceppo M17/pBR322, pColap al ceppo M17/pColap). La presenza di un plasmide in una cellula batterica deriva dalla conservazione delle sue proprietà originali (colicinogenicità e/o resistenza all'ampicillina). I risultati dell’esperimento (Fig. 2) indicano che il plasmide pBR322, privo del cer locus, viene rapidamente eliminato dalla popolazione batterica se coltivato in un ambiente privo di antibiotici, mentre gli altri due plasmidi (l’originale ColE1 e il ricombinante pColap ) vengono ereditati stabilmente dalle cellule in queste condizioni. Questa proprietà è uno degli importanti vantaggi del nostro progetto poiché, da un lato, facilita la preparazione di un farmaco standard a base di un ceppo contenente pColap e, dall'altro, garantisce che quando il farmaco viene assunto da un paziente senza concomitante terapia antibiotica, il plasmide non verrà eliminato. Applicabilità industriale. La descrizione fornita del metodo per costruire il ceppo brevettato di Escherichia coli M17 rimH::kan/pColap è sufficiente per ottenere nuovamente il ceppo utilizzando metodi, reagenti e apparecchiature standard utilizzati nella ricerca di ingegneria genetica.

Reclamo

Ceppo batterico di Escherichia coli M 17 fim H::kan/p Colap VKPM B-7448, utilizzato per ottenere un preparato probiotico.

Brevetti simili:

L'invenzione riguarda la biotecnologia, in particolare l'ingegneria genetica e la medicina, in particolare la virologia medica e l'immunologia, e può essere utilizzata per l'immunodiagnosi della febbre emorragica di Marburg, nonché per ottenere anticorpi specifici contro il virus di Marburg e vaccini geneticamente modificati contro la febbre di Marburg virus

Escherichia coli (lat. Escherichia coli, E. coli, dal nome di Theodore Escherich) è un batterio gram-negativo a forma di bastoncino, ampiamente presente nell'intestino inferiore degli organismi a sangue caldo.
Sintomi di Escherichia coli. L'intossicazione alimentare causata da alcuni ceppi di E. coli è pericolosa a causa delle tossine che producono. I sintomi dell'infezione comprendono crampi addominali e diarrea, spesso con presenza di sangue. In assenza di sintomi, la vera batteriuria (infezione del tratto urinario) viene diagnosticata se sono presenti almeno 105 corpi microbici di E. coli.

Escherichia coli (Escherichia coli, lat. Escherichia coli; abbreviazione comune Escherichia coli) è un tipo di batteri gram-negativi a forma di bastoncello che fa parte della normale microflora del tratto gastrointestinale umano.

Specie Escherichia coli ( e. coli) è compreso nel genere Escherichia (lat. escherichia), famiglia degli enterobatteri (lat. enterobatteriacee), ordine Enterobacteriaceae (lat. enterobatteri), classe Gammaproteobatteri (lat. proteobatteri γ), tipo di proteobatteri (lat. proteobatteri), regno dei batteri.

Esistono un gran numero di varietà di E. coli ( Escherichia coli), comprendenti più di 100 tipi patogeni (“enterovirulenti”), raggruppati in quattro classi: enteropatogeni, enterotossigeni, enteroinvasivi ed enteroemorragici. Non ci sono differenze morfologiche tra Escherichia patogena e non patogena.

Sintomi e segni di infezione da E. coli

L'infezione da Escherichia coli 0157:H7 di solito inizia in modo acuto con crampi addominali e diarrea acquosa, che può essere accompagnata da abbondanti quantità di sangue entro 24 ore. Alcuni pazienti descrivono la diarrea come sangue senza feci, dando origine al termine colite emorragica. La febbre è solitamente assente o lieve. A volte la temperatura corporea può salire spontaneamente fino a 39 °C. Per le infezioni non complicate, la diarrea può durare 1-8 giorni.

In circa il 5% dei casi (soprattutto nei bambini sotto i 5 anni e negli adulti sopra i 60 anni) si verifica una complicanza come la sindrome emolitico-uremica, che in casi tipici si manifesta nella 2a settimana della malattia. Sia con che senza questa complicazione può verificarsi la morte, soprattutto nelle persone anziane.

E. coli nelle urine durante la gravidanza

E. coli si trova abbastanza spesso nelle urine durante la gravidanza. Pertanto, E. coli diventa una completa sorpresa per una donna incinta. Questo di solito accade quando i test delle urine mostrano un'infiammazione che si verifica internamente. Se nell'urinocoltura si trova Escherichia coli in una concentrazione maggiore di quella consentita. Ciò significa che la concentrazione di batteri supera il limite consentito. Anche se ora non ci sono sintomi, può svilupparsi un’infezione del tratto urinario. È stato accertato che in presenza di un'infezione delle vie urinarie aumenta il rischio di parto prematuro, insufficienza placentare, rottura prematura del liquido amniotico e corioamnionite. Si verifica la nascita di bambini prematuri o funzionalmente immaturi, così come neonati con ritardo della crescita intrauterina e segni di infezione intrauterina, uno dei motivi della nascita di bambini con malformazioni congenite, ritardo mentale e paralisi cerebrale.

Escherichia coli. informazioni generali

Escherichia coli ( Escherichia coli) sono stabili nell'ambiente esterno, persistono a lungo nel suolo, nell'acqua e nelle feci. Tollerano bene l'essiccazione. Gli E. coli hanno la capacità di moltiplicarsi nei prodotti alimentari, in particolare nel latte. Muoiono rapidamente se bolliti ed esposti a disinfettanti (candeggina, formaldeide, fenolo, sublimato, soda caustica, ecc.). Gli E. coli sono più stabili nell'ambiente esterno rispetto ad altri enterobatteri. La luce solare diretta li uccide in pochi minuti, una temperatura di 60°C e una soluzione di acido fenico all'1% li uccide in 15 minuti.

Alcuni E. coli hanno flagelli e sono mobili. Altri E. coli sono privi di flagelli e della capacità di muoversi.

Escherichia coli nell'intestino e nelle feci umane

Numero di coliformi Escherichia coli tra gli altri rappresentanti della microflora intestinale non supera l'1%, ma svolgono un ruolo vitale nel funzionamento del tratto gastrointestinale. Escherichia coli e coli sono i principali concorrenti della microflora opportunistica in termini di colonizzazione dell'intestino. Escherichia coli e coli Prendono ossigeno dal lume intestinale, dannoso per i bifidobatteri e i lattobacilli benefici per l'uomo. Escherichia coli e coli produrre una serie di vitamine necessarie per l'uomo: B1, B2, B3, B5, B6, B9, B12, K, partecipa al metabolismo del colesterolo, bilirubina, colina, bile e acidi grassi e influenza l'assorbimento di ferro e calcio.

Escherichia coli nell'intestino umano compaiono nei primi giorni dopo la nascita e permangono per tutta la vita ad un livello di 10 6 -10 8 CFU/g di contenuto del colon. Nelle feci di una persona sana, gli E. coli (tipici) vengono rilevati in una quantità di 10 7 -10 8 CFU/g, mentre il numero di E. coli lattosio-negativi non deve superare 10 5 CFU/g, e quelli emolitici E. coli dovrebbe essere assente.

Le deviazioni dai valori specificati sono un segno di disbatteriosi:

una diminuzione dell'Escherichia coli tipica a 10 5 -10 6 CFU/g o un aumento del contenuto dell'Escherichia tipica a 10 9 -10 10 CFU/g è definita come disturbo microbiologico di primo grado
un aumento della concentrazione di Escherichia coli emolitico a 10 5 -10 7 CFU/g è definito come disturbo microbiologico di secondo grado

In caso di crescita eccessiva di E. coli, si consiglia ai bambini di assumere batteriofagi (a seconda del tipo di E. coli): batteriofago coli liquido, batteriofago coliproteus liquido, piobatteriofago liquido combinato, piopolifago in compresse, piobatteriofago polivalente purificato liquido o intestinale liquido batteriofago.

In caso di crescita eccessiva di Escherichia coli come conseguenza di una disbatteriosi, durante la terapia farmacologica vengono utilizzati, oltre ai batteriofagi, diversi probiotici (Bifidumbacterin, Lactobacterin, Acylact, Atsipol, ecc.) e/o adeguati ad un ceppo specifico e. coli e la causa della disbiosi - antibiotici (negli adulti).

Escherichiosi

I sierotipi patogeni di Escherichia coli possono causare escherichiosi - varie malattie infettive che si verificano con intossicazione, febbre, solitamente con danni al tratto gastrointestinale, meno spesso - vie urinarie, vie biliari, altri organi o con lo sviluppo di sepsi. L'escherichiosi è più comune nei bambini piccoli. Il meccanismo di diffusione dell'escherichiosi nel tratto gastrointestinale è fecale-orale. Molto spesso, l'infezione avviene attraverso cibo o acqua contaminati.

Escherichia coli enteropatogeno

L'Escherichia coli enteropatogeno viene spesso indicato con la sua abbreviazione latina - ETEC. Le infezioni intestinali causate da ceppi enteropatogeni di Escherichia coli si sviluppano più spesso nell'intestino tenue dei bambini nel primo anno di vita, compresi i neonati. La malattia è accompagnata da grave diarrea con feci acquose senza sangue, forte dolore addominale e vomito. Enteropatogeno Escherichia coli sono una causa comune di diarrea negli ospedali di maternità. I ceppi ETEC sono la principale causa di diarrea acquosa acuta nei paesi in via di sviluppo, soprattutto durante le stagioni calde e umide. Sia nei paesi sviluppati che in quelli in via di sviluppo, i ceppi di E. coli enteropatogeni sono la causa più comune di diarrea del viaggiatore, che di solito si risolve senza trattamento.

L'Escherichia coli enteropatogeno ha due importanti fattori di virulenza:

fattore di colonizzazione, grazie al quale l'ETEC aderisce agli enterociti dell'intestino tenue
fattore tossico: i ceppi ETEC producono enterotossine termolabili (LT) e/o termostabili (ST) che provocano la secrezione di succhi ed elettroliti, con conseguente diarrea acquosa. Gli ETEC non distruggono l'orletto a spazzola e non penetrano nella mucosa intestinale

Escherichia coli enterotossigena

Gli E. coli enterotossigeni hanno la capacità di attaccarsi alle cellule epiteliali della mucosa dell'intestino tenue e produrre tossine che causano diarrea. Gli E. coli enterotossigeni sono la principale causa di diarrea acuta nei bambini e negli adulti e la causa più comune della cosiddetta "diarrea del viaggiatore".

Escherichia coli enteroemorragica

L'Escherichia coli enteroemorragico (EHEC) è la causa della colite emorragica, nonché della grave sindrome emolitico uremica (anemia emolitica microangiopatica associata a insufficienza renale; abbreviata SEU).

La colite emorragica è caratterizzata da un esordio acuto sotto forma di forti dolori addominali crampiformi e diarrea acquosa, che presto diventa sanguinolenta. Di solito non c'è febbre, ma in alcune persone la temperatura corporea può raggiungere i 39°C. Nei casi lievi di colite emorragica, dura 7-10 giorni. In circa il 5% dei casi, la colite emorragica è complicata da sindrome emorragica, insufficienza renale acuta e anemia emolitica.

La fonte dell'infezione nel maggio 2011 in Germania e in altri paesi europei era un ceppo di Escherichia coli enteroemorragico STEC produttore della tossina Shiga (sinonimo: produttore di verotossina - VTEC).

L'infezione da E. coli STEC o VTEC avviene più spesso attraverso il cibo o attraverso il contatto ravvicinato con persone o animali malati. Un piccolo numero di STEC/VTEC è sufficiente per l'insorgenza della malattia Escherichia coli.

È stato stabilito che l'agente eziologico dell'infezione europea del maggio 2011 è l'Escherichia coli del gruppo sierologico Escherichia coli O104 (sierotipo Escherichia coli O104:H4), che ha nel suo genoma un gene responsabile della produzione della tossina Shiga-simile di tipo 2. A differenza del classico Escherichia coli enteroemorragico ( Escherichia coli O157:H7), ceppi E.coli O104:H4 non hanno il gene eae responsabile della produzione della proteina intimina, che è un fattore di adesione.

Tensioni Escherichia coli O104:H4 isolato dai pazienti era resistente agli antibiotici beta-lattamici a causa della produzione di beta-lattamasi a spettro esteso, ma rimaneva sensibile agli aminoglicosidi (gentamicina) e ai fluorochinoloni.

Dopo l'infezione da Escherichia coli enteroemorragico, il periodo di incubazione dura molto spesso da 48 a 72 ore, ma può variare da 1 a 10 giorni. I sintomi dell'infezione comprendono crampi addominali e diarrea, spesso con presenza di sangue. Possono verificarsi febbre e vomito. La maggior parte dei pazienti guarisce entro 10 giorni. A volte l’infezione può portare a condizioni potenzialmente letali come la sindrome emolitica uremica.

Escherichia coli enteroinvasiva

L'Escherichia coli enteroinvasivo viene spesso indicato con la sua abbreviazione latina - EIEC. L'E. coli enteroinvasivo causa malattie simili nella presentazione alla dissenteria bacillare (causata da Shigella). I ceppi EIEC sono simili a Shigella sia dal punto di vista biochimico che sierologico. Come nel caso Shigella, l'E. coli enteroinvasivo penetra nelle cellule epiteliali del colon e lì si moltiplica. Il paziente avverte dolore addominale e abbondante diarrea acquosa mista a sangue. Nei paesi in via di sviluppo, i ceppi EIEC sono rari. Causano epidemie periodiche di infezioni di origine alimentare tra bambini e adulti. I sintomi della malattia hanno molto in comune con le manifestazioni della shigellosi. Presumibilmente gli stessi antibiotici sono efficaci sia contro l'EIEC che contro Shigella a condizione che la sensibilità di questo ceppo rimanga in un'area particolare, tuttavia, l'efficacia della terapia non è mai stata valutata in studi controllati.

Escherichia coli - l'agente eziologico delle malattie degli organi genito-urinari

L'infezione da Escherichia coli (così come da altri microbi uropatogeni che vivono nell'intestino) degli organi genito-urinari, soprattutto nelle donne, si verifica spesso direttamente dal tratto gastrointestinale a causa della scarsa igiene o dell'uso di pratiche sessuali specifiche. L'Escherichia coli entra nella vagina dal retto. Gli E. coli sono la causa di:

circa l’80% delle infezioni del tratto urinario acquisite in comunità
Il 64% di tutte le malattie con prostatite acuta
L'80% di tutte le prostatiti croniche
per i pazienti di età superiore ai 35 anni - soprattutto epididimite (processo infiammatorio nell'epididimo), orchite (infiammazione del testicolo) ed epididimo-orchite (infiammazione combinata del testicolo e dell'epididimo)
Il 70-95% delle infezioni del tratto urinario raggiungono la vescica o i reni per via ascendente
altre malattie degli organi genito-urinari.

E. coli nelle urine

Batteriuria: la presenza di batteri nelle urine può essere un segno di infiammazione del tratto urinario, della vescica e dei reni. In assenza di sintomi, la vera batteriuria (infezione delle vie urinarie) viene diagnosticata se in 1 ml di urina appena rilasciata sono presenti almeno 10 5 corpi microbici di E. coli (o altri enterobatteri), altrimenti si presume che si sia verificata una contaminazione dell'urina. durante la raccolta. Se la batteriuria non è accompagnata da alcun sintomo, viene chiamata asintomatica. La batteriuria asintomatica non sempre richiede un trattamento immediato.

Se sono presenti sintomi o l'urina viene raccolta tramite catetere, la soglia diagnostica può essere significativamente ridotta. In particolare, in presenza di sintomi clinici (febbre, brividi, nausea, vomito, dolore alla regione lombare, disuria) e di rilascio di almeno 10 leucociti in 1 μl di urina, il criterio per diagnosticare la pielonefrite acuta è la presenza di almeno 10 4 E. coli (o altri enterobatteri patogeni) in 1 ml di urina appena rilasciata. La cistite acuta viene diagnosticata in presenza di sintomi clinici appropriati, con l'isolamento di almeno 10 leucociti in 1 μl di urina e il rilevamento di almeno 10 2 E. coli (o altri batteri coliformi) in 1 ml di urina.

Ceppi di Escherichia coli: probiotici e componenti farmaceutici

Ceppo di Escherichia coli Escherichia coli Nissle 1917(DSM 6601) è considerato il probiotico più efficace nel contribuire a ridurre l'infiammazione e ritardare il prossimo attacco di colite ulcerosa (Probiotici. Cosa sono e cosa possono fare?). Questo ceppo è incluso, in particolare, nel probiotico Mutaflor (Ardeypharm).

Ceppi di Escherichia coli appositamente selezionati sono inclusi nei medicinali: Hilak forte (ceppo DSM 4087), Bificol (ceppo M-17), Colibacterin (ceppo M-17) e altri.

Antibiotici attivi contro E. coli

Agenti antibatterici (quelli descritti in questo libro di consultazione) attivi contro E. coli: amoxicillina, levofloxacina, nifuratel, nifuroxazide, rifaximina, furazolidone, ciprofloxacina.

Il caso si è diffuso in Germania dalla settimana scorsa e giovedì sera un'altra donna è stata contagiata, ha detto un portavoce dell'ospedale universitario Eppendorf di Amburgo, citato dal canale televisivo N-24. L'infezione in Germania è stata causata dal cosiddetto batterio enteroemorragico Escherichia coli (Escherichia coli).

Il batterio Escherichia coli (E. coli) è stato riconosciuto come un problema di salute pubblica dal 1982, a seguito di un’epidemia negli Stati Uniti.

L'E. coli si trova spesso nell'intestino degli esseri umani e degli animali a sangue caldo. La maggior parte dei ceppi di E. coli sono innocui. Tuttavia, alcuni ceppi, come l’E. coli enteroemorragico (EHEC), possono causare gravi malattie di origine alimentare. Questo batterio si trasmette all'uomo principalmente attraverso il consumo di alimenti contaminati, come carni crude o poco cotte o latte crudo.

L'EHEC produce tossine conosciute come verotossine o tossine Shiga, così chiamate per la loro somiglianza con le tossine prodotte dai batteri della dissenteria Shigella.

Il numero di batteri EHEC può aumentare a temperature comprese tra +7 e +50°C (temperatura ottimale +37°C). Alcuni batteri EHEC possono aumentare negli alimenti acidi.

I batteri vengono uccisi mediante una cottura accurata dei prodotti, ovvero riscaldando tutte le parti del prodotto a una temperatura di 70°C o superiore.

Malattie causate da EHEC

I sintomi delle malattie causate dai batteri EHEC comprendono crampi addominali (spasmi della muscolatura liscia degli organi addominali) e diarrea, che in alcuni casi può diventare diarrea con sangue (colite emorragica). Sono possibili febbre e vomito.

Il periodo di incubazione dura dai tre agli otto giorni, con una durata media di tre o quattro giorni. La maggior parte dei pazienti guarisce entro 10 giorni, ma in un piccolo numero di pazienti (soprattutto bambini piccoli e anziani) la malattia può diventare grave e pericolosa per la vita: sindrome emolitica uremica (SEU). La SEU è caratterizzata da insufficienza renale acuta, anemia emolitica (anemia in cui la distruzione dei globuli rossi (eritrociti) avviene più velocemente della loro produzione da parte del midollo osseo) e trombocitopenia (una diminuzione del numero di piastrine - meno di 200 mila al 1 mm cubi - nel sangue periferico).

Si stima che il 10% dei pazienti con infezione da EHEC possa sviluppare SEU, con un tasso di mortalità compreso tra il 3 e il 5%. In tutto il mondo, la SEU è la causa più comune di insufficienza renale acuta nei bambini piccoli. Può portare a complicazioni neurologiche (come convulsioni, ictus e coma) nel 25% dei pazienti e a malattia renale cronica, solitamente lieve, in circa il 50% dei pazienti sopravvissuti.

L’incidenza delle infezioni da EHEC varia in base alla fascia di età. Il maggior numero di casi segnalati di malattia si verifica nei bambini sotto i 15 anni di età. Il 63-85% dei casi di malattia si verifica a seguito dell'esposizione a microrganismi patogeni contenuti nei prodotti alimentari. La percentuale di infezioni da EHEC che portano allo sviluppo della SEU è del 3-7% nei casi sporadici e del 20% o più nelle epidemie.

Fonti di infezione

Il serbatoio di questo microrganismo patogeno è costituito principalmente dai bovini e da altri ruminanti, come i cammelli. Si trasmette agli esseri umani principalmente attraverso il consumo di alimenti contaminati, come carni crude o poco cotte e latte crudo.

Anche la contaminazione fecale dell’acqua e di altri prodotti alimentari, nonché la contaminazione incrociata durante la preparazione del cibo (attraverso carne bovina e altri prodotti a base di carne, superfici di lavoro e utensili da cucina contaminati) possono portare a malattie.

Un numero crescente di focolai sono associati al consumo di frutta e verdura (germogli, lattuga, cavoli, insalate), che molto probabilmente derivano dal contatto con feci di animali domestici e selvatici in alcune fasi della loro coltivazione o lavorazione. I batteri EHEC sono stati trovati anche in corpi idrici (stagni, fiumi), pozzi e abbeveratoi per il bestiame. Possono rimanere vitali per diversi mesi nel letame che finisce in questi specchi d'acqua e nei sedimenti sul fondo degli abbeveratoi. La trasmissione è stata segnalata sia attraverso l'acqua potabile contaminata che attraverso le acque ricreative.

I contatti stretti tra le persone rappresentano una delle principali vie di trasmissione dell'infezione (via di infezione oro-fecale). Sono stati segnalati portatori asintomatici, cioè individui che non mostrano sintomi clinici della malattia ma sono capaci di infettare altre persone.

Il periodo di eliminazione dei batteri EHEC dall’organismo negli adulti dura una settimana o meno. Nei bambini, questo periodo può essere più lungo. Importanti fattori di rischio includono anche la visita alle fattorie e ad altri luoghi in cui sono tenuti animali dove è possibile un contatto diretto con loro.

Metodi di controllo e prevenzione

Per prevenire l’infezione, è necessario seguire misure di controllo in tutte le fasi della catena alimentare: dalla produzione agricola nelle aziende agricole alla manipolazione, lavorazione e preparazione degli alimenti sia negli stabilimenti commerciali che a casa.

Gli scienziati chiamano Escherichia coli un batterio opportunista a forma di bastoncino che può funzionare normalmente e riprodursi solo in assenza di ossigeno. Fu scoperto nel XVIII secolo da Theodor Escherich, grazie al quale prese il nome.

Del batterio esistono numerosi ceppi (varietà) e la maggior parte di essi sono considerati innocui (vivono nell'intestino umano, sono coinvolti nella sintesi di composti simili alle vitamine e hanno proprietà battericide contro alcuni microrganismi patogeni), ma esistono anche quelli che possono causare lo sviluppo di gravi problemi di salute, a partire dai disturbi del tratto gastrointestinale e terminando con lo sviluppo, quindi il trattamento di E. coli deve essere di alta qualità e tempestivo.

informazioni generali

Ceppi sicuri di questo microrganismo vivono nell'intestino umano e il loro numero varia da 10 6 a 10 8 CFU (indicatore microbiologico - unità formante colonie) per grammo di contenuto intestinale. Vale la pena ricordare subito che i batteri popolano il corpo umano nei primi giorni dopo la nascita, quindi l'E. coli appare immediatamente nei neonati e, se il loro numero non supera la norma, apporta benefici all'intestino, il che significa che non è necessario per trattare questa condizione.

Tuttavia, vale la pena ricordare che alcuni ceppi di questo microrganismo sono tossici, soprattutto per i bambini e le donne incinte (l'E. coli nelle urine durante la gravidanza può indicare lo sviluppo di una malattia infettiva acuta o cronica che minaccia la salute del feto), quindi è molto importante diagnosticare questa condizione in tempo e prescrivere un trattamento adeguato.

L'Escherichia coli può essere opportunistico (che include l'emolisi dell'Escherichia coli) e patogeno. Gli scienziati sono riusciti a isolare più di cento ceppi patogeni di questo batterio, che sono stati successivamente suddivisi in quattro classi principali, vale a dire:

enteroinvasivo;
enterotossigeno;
enteropatogeno;
enteroemorragico.

Questi microrganismi possono causare lo sviluppo dell'escherichiosi, una malattia infettiva che, secondo le statistiche, si riscontra più spesso nei bambini e nelle donne (l'infezione si trasmette per via fecale-orale, principalmente attraverso il cibo o l'acqua).

Sintomi

I sintomi dell'infezione da E. coli si manifestano in modo diverso, quindi ciascuna classe di batteri patogeni deve essere considerata separatamente. Lo stato di salute di una persona infetta dipenderà dal gruppo a cui appartengono i batteri E. coli e dalla velocità con cui si moltiplicano; i sintomi della malattia sono descritti di seguito.

Batteri enteropatogeni

I microrganismi enteropatogeni si trovano più spesso nei bambini di età inferiore a un anno e la loro presenza, di norma, viene rilevata nell'ospedale di maternità. Accompagnato da diarrea acquosa, talvolta vomito, rifiuto di mangiare e sonno agitato.

Batteri enterotossigeni

Gli E. coli enterotossigeni sono pericolosi perché possono attaccarsi specificamente alla mucosa intestinale, interrompendone significativamente il funzionamento. L'infezione viene trasmessa attraverso le mani o i frutti non lavati, quindi i sintomi dei batteri intestinali nel corpo umano sono talvolta chiamati "diarrea del viaggiatore", che è accompagnata da diarrea acquosa senza sangue, nausea e dolore addominale parossistico.

Batteri enteroemorragici

L'escherichiosi enteroemorragica è caratterizzata da diarrea mista a sangue ed è accompagnata dallo sviluppo di anemia emolitica acuta. Il pericolo della malattia è che l'E. coli emolitico distrugge le cellule del sangue e questo può portare alla morte (molto spesso la malattia colpisce le donne). Un segno caratteristico della malattia è che nelle feci si trova una grande quantità di muco e impurità verdastre, mentre l'emolisi di E. coli non provoca un aumento della temperatura corporea.

Batteri enteroinvasivi

Gli agenti patogeni enteroinvasivi causano dolore al basso addome e feci voluminose (a volte mescolate a sangue). Si verificano principalmente nei bambini e interrompono temporaneamente il funzionamento del sistema immunitario. Va detto che non esiste un quadro clinico chiaro dell'escherichiosi; i pazienti lamentano dolore addominale (che può essere localizzato in qualsiasi sua parte), feci molli e vomito, pertanto il trattamento dell'Escherichia coli deve essere globale e deve essere effettuato fuori sotto la supervisione di un medico. A proposito, E. coli lattosio-negativo non dovrebbe essere trovato nelle feci in quantità troppo grandi (la norma è 10 5), e un aumento di questo indicatore può anche essere notato indipendentemente, come evidenziato da pezzi di cibo non digerito nelle feci e l'alternanza di diarrea con stitichezza.

Escherichia coli come agente eziologico di malattie del sistema genito-urinario

Normalmente, l'E. coli non dovrebbe essere rilevato nelle urine, ma se viene trovato lì durante gli esami, il medico dovrebbe trattarlo urgentemente. Di solito, questo microrganismo viene scoperto dai ginecologi durante l'esame delle donne incinte e, per molti, la presenza di questo microrganismo nella microflora vaginale è una sorpresa. Il rilevamento di E. coli in uno striscio indica l'inizio dello sviluppo di un processo infiammatorio in uno o più organi del sistema genito-urinario (esiste la possibilità che il batterio venga trasmesso sessualmente da un partner all'altro).

Va detto che l'Escherichia coli nella vagina dovrebbe essere un motivo per lasciare il laboratorio e recarsi immediatamente nello studio del medico. Il fatto è che indebolisce significativamente l'immunità locale e rende il corpo del malato praticamente indifeso contro altri batteri pericolosi, ad esempio il proteo o lo stafilococco, che alla fine possono causare lo sviluppo o, quindi, solo uno specialista dovrebbe trattare questa condizione.

L'emolisi di E. coli è la causa dello sviluppo dell'80% delle malattie del sistema genito-urinario, che includono:

acuto e cronico (l'Escherichia coli viene rilevato in uno striscio quando si diagnostica la prostatite in quasi il 65% dei casi);
infiammazione delle ovaie nelle donne;
(se E. coli viene rilevato immediatamente in uno striscio per vaginite, il trattamento di questa malattia avviene il più rapidamente possibile e la mancanza di una terapia adeguata può causare lo sviluppo di gravi problemi di salute);
(molto spesso viene rilevato Escherichia coli emolizzante durante la diagnosi di pielonefrite nelle donne in gravidanza);
colpite e così via.

In effetti, in ginecologia, l'emolisi dell'Escherichia coli occupa un posto speciale, perché quando entra nella vagina provoca lo sviluppo di una serie di malattie che successivamente portano alla sterilità e sono difficili da trattare. Per questo motivo, i medici consigliano di prevenire e diagnosticare questo agente patogeno (l'E. coli viene determinato con uno striscio) almeno una volta all'anno.

Come trattare?

L'Escherichia coli deve essere trattata da un medico che esegue prima una coltura batterica e determina con precisione il ceppo dell'agente patogeno. L’intensità e la durata della terapia farmacologica dipendono dal tipo di batterio, dalla sua localizzazione e dalle caratteristiche individuali dell’organismo del malato. La dieta e l’assunzione di probiotici – farmaci che normalizzano la microflora intestinale – svolgono un ruolo importante nel processo di trattamento. Dopo aver completato il ciclo di terapia farmacologica, tutti i test vengono ripetuti.