Reazioni immunologiche: agglutinazione, precipitazione, lisi. Tipi di reazioni immunitarie Metodi di sondaggio genetico

PIANO q 1. Reazioni sierologiche utilizzate per la diagnosi sierologica. q 2. Test sierologici utilizzati per l'identificazione sierologica. q 3. Metodi moderni di ricerca immunologica nelle malattie infettive: (test immunoluminescente ed enzimatico, diagnostica genetica, reazione a catena della polimerasi). q 4. Reazioni sierologiche utilizzate in virologia. Q

LE REAZIONI SONO UTILIZZATE PER DUE SCOPI: q rilevare gli anticorpi nel siero del paziente utilizzando antigeni diagnostici standard - per la diagnosi sierologica di una malattia infettiva; q per la determinazione di antigeni sconosciuti (batteri, funghi, virus) dietro anticorpi standard noti - per l'identificazione sierologica di agenti patogeni.

CLASSIFICAZIONE q Le reazioni immunitarie si dividono in semplici e complesse. Per la loro produzione sono necessari due componenti principali: antigene e anticorpo. q Le reazioni semplici utilizzate per la diagnostica includono reazioni di agglutinazione, reazioni di precipitazione e reazioni di neutralizzazione. q Per reazioni complesse – metodo immunofluorescente, metodo radioimmune, metodo di dosaggio immunoenzimatico, metodo di ricerca immunoluminescente, metodo immunoblotting.

REAZIONE DI AGLUTINAZIONE q La reazione di agglutinazione (agglutinazione - incollaggio) si manifesta esternamente nell'incollaggio e nella precipitazione di antigeni corpuscolari: batteri, eritrociti e particelle con antigeni adsorbiti su di essi sotto l'influenza di anticorpi in un mezzo con un elettrolita. q La reazione avviene in due fasi. q Nella prima fase avviene l'adsorbimento specifico degli anticorpi sulla superficie di una cellula o particella che trasporta gli antigeni corrispondenti q Nella seconda fase si forma e precipita un aggregato (agglutinato) e questo processo avviene solo in presenza di un elettrolita (soluzione di cloruro di sodio).

AGGLUTINATO q L'agglutinato può essere di due tipi: a grana fine e a grana grossa. q A grana fine è il risultato dell'interazione di piccoli batteri, q A grana grossa è il risultato di batteri con flagelli.

TIPI DI REAZIONI DI AGLUTINAZIONE q Tutte le reazioni di agglutinazione sono divise in due tipi: q indicative (ORA), che vengono eseguite su vetro, q estese (PRA) - eseguite in provette con titolazione del siero.

LA REAZIONE DI AGLUTINAZIONE NON È ABBASTANZA SPECIFICA E SENSIBILE. q La specificità e la sensibilità della reazione possono essere aumentate diluendo il siero in esame al suo titolo o a metà titolo. q Il titolo del siero è la diluizione massima alla quale viene rilevata l'agglutinazione dell'antigene. q Quanto più alto è il titolo anticorpale, tanto più affidabili saranno i risultati della reazione. q Per differenziare la causa di una reazione positiva (infezione precedente, vaccinazione o malattia in corso), valutare la dinamica dell'aumento del titolo anticorpale, che si osserva solo durante un'infezione in corso. .

OBIETTIVI PRINCIPALI q Le reazioni indicative possono avere anche due scopi: q Identificazione della specie microbica (utilizzando un siero immune noto). q Ricercare gli anticorpi nel siero sanguigno del paziente utilizzando uno strumento diagnostico microbico noto.

SCHEMA DELLA REAZIONE DI AGLUTINAZIONE ORIENTATIVA. Passaggi per eseguire la reazione: v Applicare una goccia di soluzione salina sul vetro sgrassato. v Aggiungere in un'ansa la coltura batterica da testare, distribuire uniformemente in una goccia di soluzione fisiologica v Aggiungere una goccia di siero immunitario agglutinante specifico v Tenere conto del risultato della reazione. v Una reazione è considerata positiva quando il liquido nella goccia si schiarisce e si forma un agglutinato.

INTENSITÀ DI FORMAZIONE DI AGGLUTINATI + + Agglutinazione completa: sedimento molto grosso, completa limpidezza del liquido. Il risultato è positivo + + + Agglutinazione incompleta: il sedimento è lo stesso, il liquido surnatante sopra il sedimento è leggermente torbido. Il risultato è positivo + + Agglutinazione debole: piccolo sedimento, liquido opaco. Il risultato è debolmente positivo + Tracce di agglutinazione: il sedimento è piccolo, il liquido surnatante è opaco. Risultato della reazione discutibile Reazione negativa: nessun sedimento, la sospensione è uniformemente torbida.

MODIFICHE REAZIONE DI AGLUTINAZIONE: QUESTA È UNA REAZIONE. REAZIONE DI MINKEVICH E HEDDELSON v La reazione di Minkevich permette di determinare la presenza di anticorpi antitularemia in un paziente infetto. v Ingredienti necessari: v Una goccia di sangue del paziente, prelevato dal dito del paziente mediante uno scarificatore v Acqua distillata v Tularemia diagnosticum.

FASI DI ESECUZIONE DELLA REAZIONE DI MINKEVICH: v Applicare una goccia di sangue del paziente su un vetro sgrassato v Aggiungere una goccia di acqua distillata per lisare i globuli rossi v Aggiungere una goccia di tularemia diagnosticum v Prendere in considerazione i risultati. v La reazione è considerata positiva se nella goccia si formano grani agglutinati.

ESPOSIZIONE DELLA REAZIONE DI HEDDLSON PER LA BRUCELLOSI La reazione di Heddelson consente non solo di rilevare gli anticorpi nel siero di un paziente affetto da brucellosi, ma anche di determinare il titolo anticorpale. Ingredienti richiesti: v Siero del paziente v Soluzione salina v Brucellosis diagnosticum

IL PRINCIPIO DEL METODO v si basa sull'uso di una grande lastra fotografica di vetro, v siero sanguigno concentrato non diluito del paziente in volumi crescenti o decrescenti, v integrato fino ad un certo livello con soluzione fisiologica, che equivale a diverse diluizioni, e v diagnosticum colorato con blu di metilene per una migliore visibilità dell'agglutinato risultante. v L'accelerazione della reazione si ottiene mescolando gli ingredienti agitando delicatamente il vetro e ponendolo in un termostato a +37 Cº. v I sieri di diversi pazienti vengono analizzati simultaneamente su un vetrino. v Il risultato si ottiene dopo 2-5 minuti sotto forma di un agglutinato blu di attività variabile a seconda della diluizione.

LA REAZIONE DI ADSORBIMENTO DELLE AGGLUTININE DI CASTELLANI VIENE UTILIZZATA PER UNO STUDIO DETTAGLIATO DELLA STRUTTURA ANTIGENICA DEI BATTERI PER DETERMINARE IL LORO SEROVARO: q Questa reazione si basa sulla capacità di gruppi imparentati di batteri di adsorbire solo anticorpi di gruppo dall'antisiero pur mantenendo specifici del tipo anticorpi in esso. Il siero risultante è chiamato monorecettore, poiché contiene anticorpi contro un solo antigene specifico. q Se batteri diversi hanno antigeni dello stesso gruppo o di gruppi simili, possono essere agglutinati dallo stesso antisiero, il che rende difficile la loro identificazione.

Il principio del metodo: v Cross RA ha lo scopo di estrarre gli anticorpi di gruppo mediante il metodo di adsorbimento; v un antigene specifico (AG) rimuove tutti gli anticorpi dal siero, sia specifici solo per esso che quelli di gruppo; ipertensione non specifica - solo gruppo. v In questa reazione, insieme ad un antigene specifico, vengono utilizzati Ag eterologhi correlati. v Ad esempio, in un paziente con febbre tifoide (T), il siero del sangue ha dato agglutinazione con il diagnosticum specifico T e con il paratifo del gruppo A.

La reazione di agglutinazione al lattice (RAL) mediante il metodo express per la rilevazione di antigeni e anticorpi (versione orientata) Q per l'impostazione del ranga utilizza particelle sensibilizzate di lattice di polistirene con un diametro di 0, 5 1, 2 μm, che, nel presenza di un reagente immunologico omologo (antigene o anticorpi), sono incollati. Questa reazione avviene abbastanza rapidamente - entro 2-7 minuti. q Le particelle di lattice caricate con anticorpi sono ampiamente utilizzate per rilevare antigeni di virus e batteri. q Caricando il lattice con antigeni, è possibile determinare la presenza di anticorpi nel siero del paziente. q Questa modifica del RAL viene utilizzata per rilevare gli anticorpi anti-influenza, anti-rosolia, anti-morbillo, ecc.

REAZIONE DI COAGGLUTINAZIONE (COA). Lo Staphylococcus aureus (ceppo Cowan 1) viene utilizzato per stadiare il COA. La parete cellulare di questi microrganismi contiene la proteina A, che ha un'affinità significativa per il frammento Fc delle Ig. G umano e coniglio. Pertanto, molecole Ig. G dopo adsorbimento sugli stafilococchi, che hanno la proteina A, orientati nell'ambiente con i loro frammenti Fab liberi, in cui si trova il centro attivo dell'anticorpo.

REAZIONE DI COAGGLUTINAZIONE (COA). q La reazione si effettua su lastre di vetro, mescolando volumi uguali (1-2 gocce) del materiale in esame (sangue, urina, saliva, filtrati fecali, ecc.) e del diagnosticum stafilococcico. q La miscela viene accuratamente miscelata e dopo 2-5 minuti. su uno sfondo scuro, l'agglutinazione a grana fine degli stafilococchi dovrebbe essere chiaramente visibile.

LA REAZIONE DI EMAGGLUTINAZIONE INDIRETTA (PASSIVA) È LA REAZIONE SIEROLOGICA PIÙ SENSIBILE v Si basa sulla capacità degli anticorpi di interagire con l'antigene fissato su vari globuli rossi, che poi si agglutinano. v Per eseguire questa reazione è necessario preparare una soluzione diagnostica eritrocitaria. v Il diagnostico eritrocitario può essere di due tipi: antigenico e anticorpale.

FASI DI ESECUZIONE DELLA REAZIONE: Ingredienti necessari: q Siero sanguigno di un paziente infetto q Aggiungere la soluzione fisiologica nella stessa quantità di 0,25 ml nei pozzetti della compressa per diluire il siero q Aggiungere il siero sanguigno del paziente, diluito 50 volte in un volume di 0,25 ml, nel primo pozzetto; mescolare il contenuto con una pipetta e con la stessa pipetta prelevare 0,25 ml e trasferirlo nel pozzetto successivo q Mescolare il contenuto e ripetere questa procedura in tutti i pozzetti destinati alla reazione. q Preparare un controllo, per il quale aggiungere 0,25 ml di soluzione fisiologica in un pozzetto q Aggiungere 2 gocce dell'eritrocito diagnostico preparato in tutti i pozzetti, compreso quello di controllo, e mescolare agitando leggermente la compressa. q Soluzione salina q Erythrcy diagnosticum q La reazione di emoagglutinazione passiva viene eseguita nei pozzetti di una compressa immunologica.

REAZIONE DI EMAGGLUTINAZIONE INDIRETTA (PASSIVA) Un test è considerato positivo quando nei pozzetti della piastra sul fondo del controllo i globuli rossi si trovano a forma di “bottone” e nei pozzetti sperimentali appare un sedimento sotto forma di un ombrello". Schema per l'impostazione e la registrazione di RPGA

CRITERI PER CONTABILIZZARE I RISULTATI DELLA REAZIONE + + Agglutinazione completa: il sedimento occupa l'intero fondo del pozzo. Il risultato è positivo + + + Agglutinazione incompleta: il sedimento occupa tre quarti del fondo del pozzetto. Il risultato è positivo + + Agglutinazione debole: il sedimento occupa meno della metà del fondo del pozzetto. Il risultato è discutibile + Tracce di agglutinazione: piccolo sedimento. Risultato della reazione discutibile Reazione negativa: il precipitato occupa una posizione centrale con bordi arrotondati.

. REAZIONI DI AGLUTINAZIONE SVILUPPATE v Sono state proposte reazioni di agglutinazione estese per ricercare anticorpi nei sieri sanguigni di pazienti infetti per alcune infezioni batteriche. v In questo caso vengono utilizzati diagnostici preparati da microrganismi. v Per eseguire queste reazioni è necessaria una titolazione preliminare del siero.

PER EFFETTUARE QUESTE REAZIONI È NECESSARIA LA TITOLAZIONE PRELIMINARE DEL SIERO. Una diluizione di 1:10 corrisponde a 1 ml di siero + 9 ml di soluzione salina. la soluzione 1:50 è 1 ml di siero + 49 ml di soluzione salina. soluzione o 1:50 è 0,1 ml di siero + 4,9 ml di soluzione salina. la soluzione 1:100 è 1 ml di siero + 99 ml di soluzione salina. soluzione o 1: 100 è 0,1 ml di siero + 9,9 ml di soluzione salina. soluzione. v Aggiungere 2,5 ml di soluzione fisiologica in 10 provette. Saranno sperimentali 8 provette, 2 di controllo: controllo del siero e controllo dell'antigene. v Nel controllo del siero aggiungiamo solo siero diluito in un volume di 2,5 ml, nel controllo dell'antigene solo una sospensione del diagnosticum.

CONTABILIZZAZIONE DELLA REAZIONE v Aggiungere quindi 1 ml di sospensione diagnosticum in tutte le provette, ad eccezione del siero di controllo. v A causa della formazione di agglutinato, il liquido torbido nelle provette diventa limpido e sul fondo si deposita un precipitato di agglutinato. v Il conteggio della reazione inizia con i campioni di controllo: nel controllo del siero deve essere presente siero limpido, nel controllo dell'antigene deve essere presente una sospensione uniformemente torbida del diagnosticum. v Il titolo PPA viene preso in considerazione dalla diluizione del siero, nel quale è ancora chiaramente visibile la formazione di un precipitato agglutinato.

SCHEMA PER AVVIARE UNA REAZIONE DI AGLUTINAZIONE SVILUPPATA CON IL SIERO DI UN PAZIENTE SECONDO VIDAL (WRIGHT) Ingredienti Contenuto delle provette Siero di controllo Soluzione fisiologica 0,85 Antigene 0,5 - 0,5 in 0,5 Cloruro di sodio allo 0,5%, ml Diluizione del siero 1: 50 ml Breedings Diagnosticum, (1: 50) 1: 100 1 2 2 a 1: 200 1: 400 1: 800 - 2 a 2 a 2 a - 2 a miliardi di corpi microbici In termostato a +37 C° per 2 ore, poi a 18 20 ore a 1 ml. temperatura ambiente

LA REAZIONE DI PRECIPITAZIONE DIFFERISCE DALL'AGGLUTINAZIONE PER IL CARATTERE DEGLI ANTIGENI: q Nella reazione di agglutinazione sono cellule corpuscolari, anche intere, e nella reazione di precipitazione sono molecolari, in uno stato solubile. q Gli antigeni possono essere estratti di microrganismi, tessuti, organi e sostanze chimiche. q Il fenomeno della precipitazione è che gli anticorpi (precipitine), combinandosi con antigeni solubili (precipitinogeni), predeterminano la formazione di un precipitato (precipitato) o torbidità della soluzione. q Il titolo della reazione è considerato la diluizione più alta dell'antigene che dà un risultato positivo.

IL FENOMENO DELLA PRECIPITAZIONE È AMPIAMENTE UTILIZZATO NELLA PRATICA MICROBIOLOGICA: q Nell'esame medico legale, viene utilizzato per determinare la specie del sangue: è possibile stabilire a quale specie appartiene il sangue identificato. q Determinare la possibile falsificazione dei prodotti (carne, miele). Per la diagnosi di meningite cerebrospinale epidemica, peste, dissenteria, determinazione dell'infezione con l'agente patogeno dell'antrace in prodotti e materiali di origine animale (pelle, pelo, setole). q La reazione di Uchterlon viene utilizzata per determinare la composizione antigenica di organi e tessuti, sia normali che tumorali, e il numero di antigeni nei sistemi complessi. q È importante nella diagnosi della difterite, del vaiolo e di altre malattie.

REAZIONE DI MICROPRECIPITAZIONE SULL'ESEMPIO DELLA DIAGNOSI ESPRESSA DELLA SIFILIDE (EDS). q Questa reazione viene eseguita per effettuare lo screening dei sieri durante gli esami di massa per la sifilide. q Come anticorpi viene utilizzato il siero del sangue dei pazienti; l'antigene è l'antigene della cardiolipina (non specifico). La reazione viene eseguita nei pozzetti di una piastra immunologica. È necessario avere due controlli: il primo utilizza come ingredienti la soluzione salina e l'antigene della cardiolipina (controllo della torbidità), il secondo controllo utilizza un siero noto positivo e l'antigene della cardiolipina (controllo del precipitato). q Nel pozzetto del test è presente il siero del paziente in esame, prelevato ad una diluizione 1:10, e l'antigene della cardiolipina. q Dopo aver miscelato i reagenti, agitare delicatamente la piastra per 2–5 minuti; durante questo tempo si forma un precipitato e il liquido nel pozzetto diventa limpido. q La reazione viene registrata utilizzando il sistema quattro-più. Un risultato valutato come uno e due più è considerato dubbio, 3 e 4 ++++ positivo. Lo schema della reazione di microprecipitazione è mostrato in Fig. 10.

METODO PER DETERMINARE LA QUANTITÀ DI IMMUNOGLOBULINE NEL SIERO DEL SANGUE (REAZIONE DI MANCINI) Il metodo di immunodiffusione lineare semplice si basa sull'interazione dell'antisiero contenuto in un gel di agar con una soluzione antigenica per formare linee e strisce di precipitazione. q A giudicare dall'ampiezza delle zone di precipitazione nel semplice test di diffusione radiale, gli antigeni possono essere quantificati. q La posizione relativa delle linee di precipitazione nei test di immunodiffusione doppia e di controdiffusione consente di valutare la somiglianza o la differenza immunochimica dei componenti antigenici. q I metodi di immunodiffusione sono caratterizzati da elevata specificità e sensibilità. q Tipicamente, i test di immunodiffusione vengono utilizzati per identificare le proteine nei fluidi biologici come siero sanguigno, liquido cerebrospinale, secrezioni ghiandolari o estratti di vari organi, ecc.

IMMUNOELETTROFORESI q Il metodo combina la reazione di precipitazione del gel con l'elettroforesi. q A tale scopo, si applica uno strato di agar su un vetrino, si ritagliano due pozzetti sui bordi diversi e si ritaglia una scanalatura divisoria al centro. q Una miscela di antigeni viene aggiunta ai pozzetti e viene condotta l'elettroforesi per 1-2 ore. q Diversi antigeni si muovono a velocità diverse tra il catodo e l'anodo. q Successivamente si aggiunge il siero precipitante nella scanalatura e dopo 5-7 giorni si formano zone di precipitazione nel gel. q Per una migliore visualizzazione, l'agar viene colorato con coloranti (ad esempio nero amido).

La REAZIONE DELLA BATTERIOLISI q è usata raramente; viene utilizzata per la diagnosi differenziale del Vibrio cholerae da altri batteri simili al colera. q La reazione si basa sulla capacità di anticorpi specifici di formare complessi immunitari con le cellule, compresi i batteri, q che porta all'attivazione del sistema del complemento lungo la via classica e alla lisi dei batteri.

NELLA REAZIONE DELL'EMOLISI q l'antigene sono gli eritrociti e l'anticorpo sono gli anticorpi antiemolitici. q Quando si forma il complesso antigene-anticorpo, inizia l'attivazione del complemento, a seguito della quale la sospensione torbida dei globuli rossi si trasforma in un liquido trasparente rosso brillante - sangue “verniciante” a causa del rilascio di emoglobina. q Quando si imposta un test diagnostico di fissazione del complemento (CFT), la reazione di emolisi viene utilizzata come indicatore: per testare la presenza o l'assenza (fissazione) del complemento libero.

REAZIONE DI LISI E FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO. q Antigene, anticorpo e complemento necessari. q L'antigene può essere costituito da microrganismi, globuli rossi o altre cellule. q Come anticorpo viene utilizzato il siero specifico o il siero del paziente (lisina). q A seconda delle cellule contro le quali è diretta l'azione delle lisine, queste hanno i loro nomi: q contro batteri, batteriolisine, spirochetolisine, eritrociti, emolisine, contro altre cellule, citolisine. q Quando si forma un complesso di anticorpi cellulari (antigene), il complemento si lega ad esso, viene attivato in modo classico e provoca la dissoluzione cellulare. q Senza complemento, la lisi cellulare è impossibile. Esistono diverse reazioni di lisi: batteriolisi, emolisi, citolisi.

REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO (FFR). q Quando si forma un complesso antigene-anticorpo, ad esso viene sempre aggiunto il complemento. q Se l'antigene e l'anticorpo non rispondono tra loro, il complemento non si lega e rimane libero nel sistema. q Quando si aggiunge il complesso emolisina degli eritrociti di pecora, il complemento libero, legandosi ad esso, provoca l'emolisi degli eritrociti. q Questo principio costituisce la base dell'RSK. q Quando un antigene corrisponde a un anticorpo, il complemento si lega ad esso. Per verificarlo vengono aggiunti eritrociti di pecora e siero emolitico. q In assenza di emolisi, si conclude che la reazione è positiva; in presenza di emolisi, la reazione è negativa.

REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO (FFR). Sistema sperimentale ANTIGENE (batteri, cellule, virus, ecc.) ANTICORPO DEL COMPLEMENTO (siero) Il complemento ha contattato il complesso antigene-anticorpo Indicatore del sistema emolitico RAM ERITROCITI (ANTIGENE) SIERO EMOLITICO (ANTICORPO) Nessun complemento - ha contattato il sistema sperimentale. Senza complemento, l'emolisi dei globuli rossi è impossibile.

Criteri per prendere in considerazione i risultati della reazione + + Completo ritardo dell'emolisi, globuli rossi nel sedimento, il liquido surnatante è trasparente; RSC nettamente positivo. + + + Ritardo incompleto dell'emolisi, globuli rossi nel sedimento, il liquido surnatante è trasparente, leggermente rosato; RSC positivo. + + Parziale ritardo dell'emolisi, il liquido surnatante è rosso-rosa, trasparente; RSC debolmente positivo. + Leggero sedimento, liquido rosso; RSK dubbio. Emolisi completa, liquido rosso limpido. RSC negativo.

DEFINIZIONE DI ANTI-RHESUS - ANTICORPI NEL SIERO. q Questa reazione si verifica nelle donne incinte che hanno un fattore Rh negativo. q Se il padre del bambino ha un fattore Rh positivo, allora il feto può avere fattori Rh sia positivi che negativi. q Per evitare conflitti Rh è necessario sapere se durante la gravidanza si formano anticorpi anti-Rhesus q e se si formano, allora se c'è un aumento dinamico del loro titolo.

PER INIZIARE QUESTA REAZIONE SONO NECESSARI I SEGUENTI INGREDIENTI q Siero da testare q Eritrociti umani portatori di un fattore Rh positivo (eritrociti standard) q Complemento. q Fasi del test: q Aggiungere 1 ml di siero in esame in una provetta q Aggiungere una sospensione al 2% di globuli rossi standard in ciascuna provetta q Aggiungere la stessa quantità di complemento in una dose di lavoro. q Come controllo positivo utilizziamo siero contenente anticorpi anti-Rhesus; come controllo negativo - siero ovviamente negativo.

IL RISULTATO SI DÀ PER EMOLISI: q In una provetta con controllo negativo osserviamo un sedimento di globuli rossi q In una provetta con controllo positivo - emolisi completa, cioè q un liquido uniformemente colorato di rosso q Nei campioni da analizzare , in presenza di anticorpi anti-Rhesus - emolisi completa, in loro assenza - sedimento eritrocitario.

REAZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE DEL VIRUS q La reazione è ampiamente utilizzata in virologia per determinare il tipo (tipo) dell'agente patogeno e il titolo degli anticorpi neutralizzanti il virus. q Questi anticorpi vengono solitamente rilevati mescolando il siero immunitario con il virus corrispondente e quindi iniettando la miscela in animali da laboratorio sensibili o infettando una coltura cellulare. q In base alla sopravvivenza dell'animale nel primo caso o all'assenza dell'effetto citopatico del virus nel secondo, si valuta l'attività neutralizzante del siero.

REAZIONE DI INIBIZIONE DELL'EMAGLUTINAZIONE (HAI) q q Basata sulla proprietà dell'antisiero di sopprimere l'emoagglutinazione virale, poiché il virus neutralizzato da anticorpi specifici perde la capacità di agglutinare i globuli rossi. L'RTGA è ampiamente utilizzato per la sierodiagnosi delle infezioni virali al fine di rilevare antiemoagglutinine specifiche e identificare molti virus tramite le loro emoagglutinine (antigeni).

REAZIONI CHE COINVOLGONO ANTIGENI O ANTICORPI MARCATI q Coinvolgono antigeni o anticorpi marcati. q Questi includono reazioni di immunofluorescenza, q radioimmuni q metodi di dosaggio immunoenzimatico. q La loro sensibilità è superiore a tutte le reazioni sierologiche sopra descritte.

REAZIONI DI IMMUNOFLUORESCENZA (COONCH) METODO DIAGNOSTICO ESPRESSO, q Per identificare gli antigeni microbici nei tessuti, è stato utilizzato siero diagnostico etichettato contenente anticorpi contro determinati tipi (varianti) di microrganismi (batteri, virus). q La marcatura degli anticorpi viene eseguita con fluorocromi (isotiocianato di fluoresceina)

METODO DI ANALISI ELISA IMMUNO - ELISA q prevede l'uso di reagenti commerciali - antigeni o anticorpi marcati con enzimi (ad esempio perossidasi o fosfatasi alcalina). q Il metodo viene eseguito in piastre di polistirene, dove l'antigene o l'anticorpo viene fissato nei pozzetti. q Dopo la formazione dell'immunocomplesso viene introdotto nel sistema un substrato che viene scisso dall'enzima, provocando la colorazione del terreno. q A differenza dei metodi di rilevamento classici, ELISA consente di registrare direttamente l'interazione di un antigene con un anticorpo in una fase specifica, q e di non analizzare manifestazioni secondarie di interazione - agglutinazione, precipitazione o emolisi. q Il metodo si distingue per l'elevata sensibilità: solitamente è sufficiente la presenza dell'antigene ad una concentrazione di 1 ng ml.

FASI DI ESECUZIONE DELLA REAZIONE (BASATA SULL'ESEMPIO DI DIAGNOSI DI ANTICORPI PER L'INFEZIONE DA HIV): q Il siero del sangue del paziente viene aggiunto ai pozzetti di una piastra di polistirene su cui è assorbito l'antigene dell'HIV. Il primo pozzetto è destinato all'aggiunta di siero ovviamente positivo, il secondo - ovviamente negativo q Incubiamo la piastra in una camera umida per 30 minuti q Laviamo i pozzetti della piastra con soluzione salina tamponata con fosfato 5 volte q Aggiungiamo antisiero contenente anticorpi contro immunoglobuline umane marcate con un enzima in tutti i pozzetti q Laviamo i pozzetti con soluzione salina tamponata con fosfato 5 volte q Aggiungere un substrato contenente perossido di idrogeno e benzidina a tutti i pozzetti q Conservare la piastra in un luogo buio per 20 minuti q Registrare visivamente i risultati e determinare la densità ottica della soluzione in ciascun pozzetto utilizzando un dispositivo

METODO ELISA IMMUNO - ELISA q Quando il test viene eseguito correttamente, il colore del pozzetto contenente il siero di controllo positivo cambia e diventa giallo. q Nel controllo negativo il colore è trasparente. q La contabilizzazione dei risultati dei campioni sperimentali dipende dal cambiamento di colore nel pozzetto del test: se cambia, come nel controllo positivo, significa che in questo paziente sono stati rilevati anticorpi contro l'HIV.

SEMPLIFICARE L'UTILIZZO DEI SISTEMI ELISA “REAGENT-FREE” q Per effettuare l'analisi è sufficiente applicare un campione al carrier ed osservare visivamente il cambiamento di colore del carrier che avviene a causa della formazione del prodotto della reazione enzimatica. q Vantaggi: q non vengono utilizzati isotopi radioattivi, q la stabilità degli oniugati ne consente la conservazione a lungo termine, q le misurazioni della densità ottica vengono effettuate nel campo ottico, q i risultati ELISA possono essere valutati in modo semiquantitativo senza l'uso delle attrezzature (visivamente). q ELISA è molto facile da automatizzare.

ANALISI RADIOIMMUNOLOGICA (RIA) q Vantaggio della RIA: non è necessario valutare la reazione in corso attraverso manifestazioni secondarie, quali agglutinazione, precipitazione, lisi dei globuli rossi. q 2 opzioni: q gli antigeni marcati e non marcati competono per un numero limitato di siti di legame con anticorpi specifici. q Affinché si verifichi un'interazione competitiva, deve esserci un certo grado di correlazione tra l'antigene marcato e quello non marcato. q Dopo due fasi di incubazione degli anticorpi, prima con l'antigene in esame e poi con l'antigene marcato standard, q la quantità di antigene marcato incluso negli immunocomplessi sarà inversamente proporzionale alla quantità di antigene non marcato presente nel campione del test. .

FONTI DI INFORMAZIONE: Base A. §. Korotyaev A. I., Babichev S. A. Microbiologia medica, immunologia e virologia. -S-P. , 2000. § Microbiologia medica. /Ed. V. I. Pokrovsky. M., 2001. § L. B. Borisov. Microbiologia medica, virologia, immunologia. M., 2001 § Microbiologia medica, virologia / Ed. A. A. Vorobyova. M.2004.

Interazione in vitro tra antigeni specifici e anticorpi è chiamata reazione immunologica, che consiste in una fase specifica e una fase non specifica. IN fase specifica si verifica un rapido legame specifico del centro attivo dell'anticorpo con il determinante dell'antigene. Poi arriva fase non specifica- più lento, che si manifesta con fenomeni fisici visibili, ad esempio la formazione di scaglie (fenomeno di agglutinazione) o di precipitato sotto forma di torbidità. Questa fase richiede la presenza di determinate condizioni (elettroliti, pH ottimale dell'ambiente).

Legame del determinante dell'antigene (epitopo) al sito attivo Favoloso-il frammento anticorpale è dovuto alle forze di van der Waals, ai legami idrogeno e alle interazioni idrofobiche. La forza e la quantità di antigene legato dagli anticorpi dipendono dall'affinità, dall'avidità degli anticorpi e dalla loro valenza.

In microbiologia e immunologia vengono utilizzate reazioni di agglutinazione, precipitazione, neutralizzazione, reazioni che coinvolgono il complemento, utilizzando anticorpi e antigeni marcati (metodi radioimmunologici, immunoenzimatici, immunofluorescenti). Le reazioni elencate differiscono nell'effetto registrato e nella tecnica di produzione, tuttavia, si basano tutte sulla reazione di interazione di antigeni specifici con anticorpi e vengono utilizzate per rilevare sia anticorpi che antigeni. Le reazioni immunologiche sono caratterizzate da elevata sensibilità e specificità.

Metodo sierologico.

Dal latino siero ¾ siero: sierologia ¾ una sezione dell'immunologia che studia i modelli di interazione tra AG e AT nel siero del sangue. Di conseguenza, le reazioni AG+AT che si verificano in vitro sono chiamate reazioni sierologiche. La sierologia ha un'enorme importanza applicata e pratica nella moderna diagnosi clinica di laboratorio di malattie infettive, autoimmuni, endocrine e di altro tipo.

Metodo di ricerca sierologico (diagnosi) ¾ è un metodo basato sullo studio del siero del paziente per determinare gli anticorpi in esso contenuti. Attualmente, il concetto di metodo sierologico è stato ampliato, poiché sono state sviluppate reazioni sierologiche altamente sensibili che comportano il rilevamento di AT non solo nel siero sanguigno dei pazienti, ma anche in altri fluidi biologici: saliva, liquido cerebrospinale, biosecreti).

Caratteristiche principali:

1) l'interazione tra AG e AT è strettamente specifica;

2) la reazione sierologica avviene quando equivalente(corrispondenti tra loro) rapporti degli importi di AG e AT;

3) la reazione sierologica ha un carattere a due fasi:

· interazione specifica ¾ fase invisibile;

· formazione di complessi visibili ¾ – per questo viene aggiunta la soluzione fisiologica;

4) la reazione sierologica avviene secondo il tipo di reazione fisico-chimica in un sistema colloidale;

5) viene rilasciata una piccola quantità di calore.

Scopi dell'utilizzo delle reazioni sierologiche:

1) l'identificazione sierologica è la determinazione del tipo di antigene sconosciuto utilizzando AT noto (siero diagnostico immunitario). In questo caso:

a) Ag sconosciuti ¾ si tratta di microrganismi patogeni e non patogeni, tossine di varia origine, proteine del sangue, cellule di diversi organi e tessuti di un'altra specie o gruppo, cellule trapiantate;

b) AT noti ¾ si tratta di preparati standard ¾ sieri immunodiagnostici (IDS) specifici per un determinato AG (cercato)

2) diagnosi sierologica (metodo)¾ si tratta della determinazione di antigeni sconosciuti nel siero sanguigno del paziente o in altri fluidi biologici utilizzando un antigene noto (diagnosticum).

a) AT sconosciuti ¾ sono gli AT desiderati nel siero sanguigno di persone ¾ malate, guarite, portatrici, vaccinate;

b) diagnosticum ¾ sono preparati standard ottenuti da colture pure di microrganismi di determinate specie o dai loro antigeni. I microrganismi vengono coltivati, poi inattivati, standardizzati (il numero di microbi per unità di volume); l'inattivazione viene effettuata: mediante riscaldamento, formaldeide, alcool, ecc. (diagnosticum perde la patogenicità, ma conserva le proprietà antigeniche).

Concetti base di sierologia Diagnosticum ¾ sospensione di microbi uccisi. Titolo anticorpale¾la diluizione più alta del siero in esame alla quale si è verificata una reazione positiva (agglutinazione, fissazione del complemento, ecc.). Titolo diagnostico¾il titolo più basso di anticorpi specifici in una persona affetta da questa infezione, per cui la reazione può essere considerata specifica (positiva). Sieri accoppiati¾ due sieri di un paziente, il primo dei quali viene prelevato al 5-8 giorno di malattia, il secondo ¾ dopo 10-14 giorni, per valutare la dinamica della risposta immunitaria. Il fenomeno dell'aumento del titolo anticorpale è un aumento della concentrazione di anticorpi specifici nei sieri accoppiati in studio di 4 o più volte, indicando la presenza di questa malattia in una persona al momento.

Reazione di agglutinazione

Reazione di agglutinazione (RA)(lat. agglutinazione¾ adesione) una reazione in cui gli anticorpi si legano ad antigeni corpuscolari (insolubili) (batteri, eritrociti o altre cellule, particelle insolubili con antigeni adsorbiti su di essi). Si verifica in presenza di elettroliti, ad esempio, quando viene aggiunta una soluzione isotonica di cloruro di sodio.

La reazione di agglutinazione si manifesta con la formazione di scaglie o sedimenti (cellule “incollate tra loro” da anticorpi che hanno due o più centri di legame con l'antigene). RA viene utilizzato per: determinazione degli anticorpi nel siero sanguigno dei pazienti (ad esempio, con brucellosi ¾ reazione di Wright, reazione di Heddelson, con febbre tifoide e paratifo (reazione di Vidal) e altre infezioni), identificazione dell'agente patogeno isolato dal paziente ;

Per determinare gli anticorpi del paziente, hanno messo reazione di agglutinazione dettagliata: aggiungere alle diluizioni del siero sanguigno del paziente diagnosticum e dopo 2 ore di incubazione a 37°C e 18-20 ore a temperatura ambiente, si nota la diluizione del siero (titolo del siero) più alta alla quale si è verificata l'agglutinazione, cioè la formazione di un precipitato.

La natura e la velocità dell'agglutinazione dipendono dal tipo di antigene e di anticorpi. Un esempio sono le peculiarità dell'interazione dei diagnostici (antigeni O e H) con anticorpi specifici. Reazione di agglutinazione con O-diagnosticum(batteri uccisi dal calore, che si mantengono stabili al calore antigene O) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l'antigene H flagellare termolabile) è grossolana e procede più velocemente.

Se è necessario determinare l'agente patogeno isolato dal paziente, inserire reazione di agglutinazione indicativa, utilizzando anticorpi diagnostici (siero agglutinante), cioè viene effettuata la sierotipizzazione dell'agente patogeno. Una reazione indicativa viene effettuata su un vetrino. Una coltura pura del patogeno isolato dal paziente viene aggiunta ad una goccia di siero agglutinante diagnostico diluito con soluzione fisiologica 1:10 o 1:20. Accanto viene posto un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione isotonica di cloruro di sodio. Quando appare un sedimento flocculante in una goccia contenente siero e microbi, a estesa reazione di agglutinazione in provette con diluizioni crescenti di siero agglutinante, a cui si aggiungono 2-3 gocce della sospensione del patogeno. L'agglutinazione viene presa in considerazione dalla quantità di sedimenti e dal grado di limpidezza del liquido. La reazione è considerata positiva se si osserva agglutinazione in una diluizione vicina al titolo del siero diagnostico. Allo stesso tempo, vengono presi in considerazione i controlli: il siero diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio deve essere trasparente, la sospensione dei microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza grumi.

Diversi batteri correlati possono essere agglutinati dallo stesso siero agglutinante diagnostico, il che rende difficile la loro identificazione. Pertanto usano sieri agglutinanti adsorbiti, da cui gli anticorpi che reagiscono in modo crociato sono stati rimossi mediante adsorbimento su batteri correlati. Tali sieri trattengono anticorpi specifici solo per un dato batterio. La produzione di sieri agglutinanti diagnostici monorecettori in questo modo fu proposta da A. Castellani (1902).

Reazione di coagglutinazione. Le cellule patogene vengono determinate utilizzando stafilococchi pretrattati con siero diagnostico immunologico. Gli stafilococchi contenenti la proteina A, che ha un'affinità per il frammento Fc delle immunoglobuline, adsorbono in modo non specifico gli anticorpi antimicrobici, che poi interagiscono con i centri attivi con i corrispondenti microbi isolati dai pazienti. Come risultato della coagglutinazione, si formano scaglie costituite da stafilococchi, anticorpi sierici diagnostici e il microbo rilevato.

Negli ultimi anni, la gamma di diagnosi dei microbi uccisi è stata integrata dalle cosiddette sospensioni Ag e AT, adsorbite su vari supporti corpuscolari inerti. Tra questi, il metodo più diffuso è agglutinazione al lattice , basato sull'interazione di Ag (o AT) in un campione con particelle di lattice caricate con specifico AT monoclonale (o Ag), che porta alla rapida formazione di aggregati visibili.

13.1. Reazioni antigene-anticorpo e loro applicazioni

Quando viene introdotto un antigene, nel corpo si formano anticorpi. Gli anticorpi sono complementari all'antigene che ne ha causato la sintesi e sono in grado di legarsi ad esso. Il legame degli antigeni agli anticorpi consiste di due fasi. La prima fase è specifica, in cui avviene il rapido legame del determinante antigenico al centro attivo del frammento Fab degli anticorpi. Va notato che il legame è dovuto alle forze di van der Waals, all'idrogeno e alle interazioni idrofobiche. La forza del legame è determinata dal grado di corrispondenza spaziale tra il sito attivo dell'anticorpo e l'epitopo dell'antigene. Dopo la fase specifica, inizia una fase più lenta, non specifica, che si manifesta con un fenomeno fisico visibile (ad esempio la formazione di scaglie durante l'agglutinazione, ecc.).

Le reazioni immunitarie sono interazioni tra anticorpi e antigeni e queste reazioni sono specifiche e altamente sensibili. Sono ampiamente utilizzati nella pratica medica. Con l'aiuto delle reazioni immunitarie, è possibile risolvere i seguenti problemi:

Determinazione di anticorpi sconosciuti mediante antigeni noti (antigenic diagnosticum). Questo compito si verifica quando è necessario determinare gli anticorpi contro un agente patogeno nel siero del paziente (sierodiagnosi). Il reperimento degli anticorpi permette di confermare la diagnosi;

Determinazione di antigeni sconosciuti utilizzando anticorpi noti (siero diagnostico). Questo studio viene effettuato quando si identifica una coltura patogena isolata dal materiale di un paziente (sierotipizzazione), nonché quando si rileva

antigeni microbici e loro tossine nel sangue e in altri fluidi biologici. Esistono molti tipi di reazioni immunitarie, che differiscono nella tecnica di stadiazione e nell'effetto registrato. Si tratta di reazioni di agglutinazione (RA), reazioni di precipitazione (RP), reazioni che coinvolgono il complemento (RSC), reazioni che utilizzano componenti marcati (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reazione di agglutinazione

Una reazione di agglutinazione (RA) è una reazione immunitaria dell'interazione di un antigene con anticorpi in presenza di elettroliti e l'antigene si trova in uno stato corpuscolare (eritrociti, batteri, particelle di lattice con antigeni adsorbiti). Durante l'agglutinazione, gli antigeni corpuscolari vengono incollati insieme dagli anticorpi, il che si manifesta con la formazione di un precipitato flocculante. La formazione di scaglie avviene a causa del fatto che gli anticorpi hanno due centri attivi e gli antigeni sono polivalenti, cioè hanno diversi determinanti antigenici. L'AR viene utilizzato per identificare l'agente patogeno isolato dal materiale del paziente, nonché per rilevare gli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue del paziente (ad esempio, le reazioni di Wright e Heddleson per la brucellosi, la reazione di Widal per la febbre tifoide e la febbre paratifoide).

Il modo più semplice per diagnosticare l'AR è la reazione sul vetro; si tratta di un'AR approssimativa, che viene utilizzata per determinare l'agente patogeno isolato dal paziente. Una volta stabilita la reazione, si applica il siero agglutinante diagnostico su un vetrino (a una diluizione di 1:10 o 1:20), quindi si aggiunge una coltura del paziente. La reazione è positiva se nella goccia appare un sedimento flocculante. Accanto viene posto un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Se il siero agglutinante diagnostico non viene adsorbito 1, viene diluito (al titolo - la diluizione alla quale dovrebbe avvenire l'agglutinazione), ad es. mettere l'RA espanso nelle provette con aumento

1 Il siero agglutinante non assorbito può agglutinare batteri correlati che presentano antigeni comuni (reattivi). Pertanto usanosieri agglutinanti adsorbiti, da cui gli anticorpi che reagiscono in modo crociato sono stati rimossi mediante adsorbimento su batteri correlati. Tali sieri trattengono anticorpi specifici solo per un dato batterio.

diluizioni di siero agglutinante, a cui vengono aggiunte 2-3 gocce di una sospensione dell'agente patogeno isolato dal paziente. L'agglutinazione viene presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di limpidezza del liquido nelle provette. La reazione è considerata positiva se si osserva agglutinazione in una diluizione vicina al titolo del siero diagnostico. La reazione è accompagnata da controlli: il siero diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio deve essere trasparente, la sospensione dei microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza sedimenti.

Per determinare gli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue del paziente, viene utilizzata l'AR su vasta scala. Durante la preparazione, il siero del sangue del paziente viene diluito in provette e una uguale quantità di sospensione diagnosticum (sospensione di microbi uccisi) viene aggiunta alle provette. Dopo l'incubazione, viene determinata la diluizione del siero più alta alla quale si è verificata l'agglutinazione, vale a dire si è formato un precipitato (titolo del siero). In questo caso, la reazione di agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal calore, conservando l'antigene O termostabile) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l'antigene H flagellare termolabile) è grossolana e procede più velocemente.

Reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva).(RNGA o RPGA) è un tipo di RA. Questo metodo è altamente sensibile. Con l’aiuto dell’RNGA si possono risolvere due problemi: determinare gli anticorpi nel siero del paziente, a cui viene aggiunto un antigene eritrocitario diagnostico, ovvero eritrociti su cui sono adsorbiti antigeni noti; determinare la presenza di antigeni nel materiale di prova. In questo caso, la reazione è talvolta chiamata reazione di emoagglutinazione indiretta inversa (RONHA). Durante la procedura, al materiale del test viene aggiunto un anticorpo eritrocitario diagnostico (eritrociti con anticorpi adsorbiti sulla superficie). In questa reazione, i globuli rossi agiscono come trasportatori e sono passivamente coinvolti nella formazione degli aggregati immunitari. Con una reazione positiva, i globuli rossi incollati passivamente coprono il fondo del foro in uno strato uniforme con bordi smerlati (“ombrello”); in assenza di agglutinazione, i globuli rossi si accumulano nella cavità centrale del foro, formando un “bottone” compatto dai bordi ben definiti.

Reazione di coagglutinazione utilizzato per determinare le cellule patogene (antigeni) utilizzando anticorpi adsorbiti Staphylococcus aureus, contenente proteina A. La proteina A ha un'affinità per il frammento Fc delle immunoglobuline. Grazie a ciò, gli anticorpi si legano allo stafilococco indirettamente attraverso il frammento Fc, mentre i frammenti Fab sono orientati verso l'esterno e sono in grado di interagire con i corrispondenti microbi isolati dai pazienti. In questo caso si formano dei fiocchi.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI) utilizzato nella diagnosi delle infezioni virali e solo delle infezioni causate da virus emoagglutinanti. Questi virus contengono una proteina sulla loro superficie: l'emoagglutinina, che è responsabile della reazione di emoagglutinazione (HRA) quando i globuli rossi vengono aggiunti ai virus. RTGA comporta il blocco degli antigeni virali con anticorpi, a seguito dei quali i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi.

Reazione di Coombs - RA per la determinazione degli anticorpi incompleti. In alcune malattie infettive, come la brucellosi, gli anticorpi incompleti contro l’agente patogeno circolano nel siero del paziente. Gli anticorpi incompleti sono chiamati anticorpi bloccanti perché hanno un sito di legame con l’antigene e non due, come gli anticorpi completi. Pertanto, quando viene aggiunto un diagnosticum antigenico, gli anticorpi incompleti si legano agli antigeni, ma non li uniscono insieme. Per manifestare la reazione, viene aggiunto siero antiglobulina (anticorpi contro le immunoglobuline umane), che porterà all'agglutinazione degli immunocomplessi (diagnostico antigenico + anticorpi incompleti) formati nella prima fase della reazione.

La reazione indiretta di Coombs viene utilizzata nei pazienti con emolisi intravascolare. In alcuni di questi pazienti vengono rilevati anticorpi anti-Rhesus monovalenti incompleti. Interagiscono specificamente con gli eritrociti Rh-positivi, ma non provocano la loro agglutinazione. Pertanto, il siero antiglobulina viene aggiunto al sistema di anticorpi anti-Rh + eritrociti Rh-positivi, che provoca l'agglutinazione degli eritrociti. Utilizzando la reazione di Coombs, vengono diagnosticate condizioni patologiche associate alla lisi intravascolare degli eritrociti di origine immunitaria, ad esempio la malattia emolitica del neonato causata dal conflitto Rh.

RA per la determinazione dei gruppi sanguigni si basa sull'agglutinazione degli eritrociti da parte degli anticorpi del siero immunitario contro gli antigeni del gruppo sanguigno A(II), B(III). Il controllo è un siero che non contiene anticorpi, cioè siero del gruppo sanguigno AB(IV) e antigeni eritrocitari dei gruppi A(P) e B(III). I globuli rossi del gruppo 0 (I) vengono utilizzati come controllo negativo perché non contengono antigeni.

Per la determinazione del fattore Rh vengono utilizzati sieri anti-Rh (almeno due serie diverse). Se è presente un antigene Rh sulla membrana degli eritrociti in esame, si verifica l'agglutinazione di queste cellule.

13.3. Reazione di precipitazione

RP è una reazione immunitaria dell'interazione di anticorpi con antigeni in presenza di elettroliti e l'antigene è in uno stato solubile. Durante la precipitazione, gli antigeni solubili vengono precipitati dagli anticorpi, che si manifesta con torbidezza sotto forma di bande di precipitazione. La formazione di un precipitato visibile si osserva quando entrambi i reagenti vengono miscelati in rapporti equivalenti. Un eccesso di uno di essi riduce il numero di complessi immuni precipitati. Esistono vari modi per eseguire la reazione di precipitazione.

Reazione di precipitazione dell'anello posti in tubi di precipitazione di piccolo diametro. Il siero immunitario viene aggiunto alla provetta e l'antigene solubile viene accuratamente stratificato. Se il risultato è positivo, all'interfaccia delle due soluzioni si forma un anello lattiginoso. La reazione di precipitazione dell'anello, che viene utilizzata per determinare la presenza di antigeni negli organi e nei tessuti, i cui estratti vengono bolliti e filtrati, è chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli per la determinazione dell'antigene dell'antrace termostabile).

Doppia reazione di immunodiffusione di Ouchterlony. Questa reazione viene effettuata in un gel di agar. In uno strato di gel di spessore uniforme, i pozzetti vengono ritagliati ad una certa distanza l'uno dall'altro e riempiti rispettivamente con antigene e siero immunitario. Successivamente, gli antigeni e gli anticorpi si diffondono nel gel, si incontrano e formano complessi immunitari, che precipitano nel gel e diventano visibili come linee di precisione.

nutrizione. Questa reazione può essere utilizzata per identificare antigeni o anticorpi sconosciuti, e anche per testare la somiglianza tra diversi antigeni: se gli antigeni sono identici, le linee di precipitazione si fondono, se gli antigeni non sono identici, le linee di precipitazione si intersecano, se gli antigeni sono parzialmente identico, si forma uno sperone.

Reazione di immunodiffusione radiale. Gli anticorpi vengono aggiunti al gel di agar fuso e il gel viene applicato in uno strato uniforme sul vetro. I pozzetti vengono ritagliati nel gel e ad essi viene aggiunto un volume standard di soluzioni antigeniche di diverse concentrazioni. Durante l'incubazione, gli antigeni si diffondono radialmente dal pozzetto e, incontrando gli anticorpi, formano un anello di precipitazione. Finché nel pozzetto rimane l'antigene in eccesso, si verifica un graduale aumento del diametro dell'anello di precipitazione. Questo metodo viene utilizzato per determinare antigeni o anticorpi nella soluzione test (ad esempio, per determinare la concentrazione di immunoglobuline di diverse classi nel siero del sangue).

Immunoelettroforesi. La miscela di antigeni viene prima separata elettroforeticamente, quindi l'antisiero precipitante viene aggiunto nella scanalatura che corre lungo la direzione del movimento delle proteine. Gli antigeni e gli anticorpi si diffondono nel gel gli uni verso gli altri; interagendo, formano linee arcuate di precipitazione.

Reazione di flocculazione(secondo Ramon) - un tipo di reazione di precipitazione che viene utilizzata per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide. La reazione viene effettuata in provette. In una provetta in cui il tossoide e l'antitossina sono in rapporto equivalente, si osserva torbidità.

13.4. Reazione di fissazione del complemento

Gli anticorpi, interagendo con l'antigene corrispondente, si legano al complemento aggiunto (1° sistema). Un indicatore della fissazione del complemento sono gli eritrociti sensibilizzati con siero emolitico, ad es. anticorpi contro i globuli rossi (2° sistema). Se il complemento non è fisso nel 1° sistema, cioè Se la reazione antigene-anticorpo non avviene, i globuli rossi sensibilizzati vengono completamente lisati (reazione negativa). Quando il complemento viene fissato dagli immunocomplessi del 1° sistema dopo l'aggiunta di eritrociti sensibilizzati, si verifica l'emolisi da

assente (reazione positiva). La reazione di fissazione del complemento viene utilizzata per diagnosticare malattie infettive (gonorrea, sifilide, influenza, ecc.).

13.5. Reazione di neutralizzazione

I microbi e le loro tossine hanno un effetto dannoso sugli organi e sui tessuti del corpo umano. Gli anticorpi sono in grado di legarsi a questi agenti dannosi e bloccarli, ad es. neutralizzare. La reazione di neutralizzazione diagnostica si basa su questa caratteristica degli anticorpi. Si effettua introducendo una miscela antigene-anticorpo negli animali o in oggetti di test sensibili (colture cellulari, embrioni). Ad esempio, per rilevare le tossine nel materiale di un paziente, agli animali del 1° gruppo viene iniettato il materiale del paziente. Agli animali del 2° gruppo viene iniettato materiale simile, pretrattato con l'apposito antisiero. Gli animali del gruppo 1 muoiono se nel materiale è presente una tossina. Il secondo gruppo di animali sopravvive; l'effetto dannoso della tossina non si manifesta, poiché viene neutralizzata.

13.6. Reazioni che utilizzano anticorpi o antigeni marcati

13.6.1. Reazione di immunofluorescenza (RIF, metodo Koons)

Questo metodo viene utilizzato per la diagnostica rapida. Può essere utilizzato per rilevare sia antigeni microbici che anticorpi.

Metodo RIF diretto- una reazione immunitaria derivante dall'interazione di anticorpi con antigeni e gli anticorpi sono marcati con un fluorocromo - una sostanza in grado di emettere quanti di luce di una certa lunghezza d'onda quando esposta alla luce di una certa lunghezza d'onda. La particolarità di questo metodo è la necessità di rimuovere i componenti non reagiti al fine di escludere la rilevazione di luminescenza aspecifica. Per fare questo, lavare gli anticorpi non reagiti. I risultati vengono valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza. I batteri in uno striscio trattato con un siero così luminescente si illuminano su uno sfondo scuro lungo la periferia della cellula.

Metodo RIF indiretto viene utilizzato più spesso del precedente. Questa reazione viene effettuata in due fasi. Nella prima fase, gli antigeni si scambiano reciprocamente

interagiscono con gli anticorpi corrispondenti, formando immunocomplessi. Tutti i componenti che non hanno reagito (cioè che non fanno parte degli immunocomplessi) devono essere rimossi mediante lavaggio. Nella seconda fase, il complesso antigene-anticorpo risultante viene rilevato utilizzando siero antiglobulina fluorocromizzato. Di conseguenza, si forma un complesso di microbo + anticorpi antimicrobici di coniglio + anticorpi contro le immunoglobuline di coniglio, marcati con fluorocromo. I risultati vengono valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza.

13.6.2. Metodo o analisi di immunoassorbimento enzimatico

L'ELISA è il metodo moderno più comune utilizzato per la diagnosi di infezioni virali, batteriche, protozoarie, in particolare per la diagnosi dell'infezione da HIV, dell'epatite virale, ecc.

Ci sono molte modifiche ELISA. L'ELISA non competitivo in fase solida è ampiamente utilizzato. Viene effettuata in piastre di polistirene da 96 pozzetti (fase solida). Quando si esegue una reazione, è necessario lavare via i componenti non reagiti in ogni fase. Quando si determinano gli anticorpi, il siero del sangue in esame viene aggiunto ai pozzetti su cui sono assorbiti gli antigeni, quindi il siero antiglobulina viene marcato con un enzima. La reazione viene effettuata aggiungendo un substrato per l'enzima. In presenza di un enzima, il substrato cambia e il complesso enzima-substrato viene selezionato in modo che il prodotto formato nella reazione venga colorato. Pertanto, con una reazione positiva, si osserva un cambiamento nel colore della soluzione. Per determinare gli antigeni, il carrier in fase solida viene sensibilizzato con anticorpi, quindi vengono aggiunti in sequenza il materiale di prova (antigeni) e il siero marcato con enzima agli antigeni. Affinché la reazione avvenga, viene aggiunto un substrato per l'enzima. Un cambiamento nel colore della soluzione avviene con una reazione positiva.

13.6.3. Immunoblot

Questo metodo si basa su una combinazione di elettroforesi ed ELISA. Quando si esegue l'immunoblotting (blotting dall'inglese. macchia- spot) una miscela complessa di antigeni viene prima sottoposta ad elettroforesi in gel di poliacrilammide. Il risultante anti-

i peptidi genici vengono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa. Le macchie vengono quindi trattate con anticorpi marcati con enzima contro un antigene specifico, ad es. eseguire il test ELISA. L'immunoblotting viene utilizzato nella diagnosi di infezioni come l'HIV.

13.6.4. Microscopia elettronica immune

Il metodo prevede la microscopia dei virus (meno comunemente altri microbi) in un microscopio elettronico, pretrattati con il siero immunitario appropriato marcato con preparati elettro-otticamente densi, ad esempio la ferritina, una proteina contenente ferro.

13.7. Citometria a flusso

Le cellule del sangue vengono differenziate in base alla citofluorimetria laser. Per fare ciò, le cellule desiderate vengono colorate con anticorpi monoclonali fluorescenti contro gli antigeni CD. Il campione di sangue, dopo essere stato trattato con anticorpi marcati, viene fatto passare attraverso un tubo sottile e attraverso di esso viene fatto passare un raggio laser, che eccita il fluorocromo a brillare. L'intensità della fluorescenza è correlata alla densità degli antigeni sulla superficie cellulare e può essere misurata quantitativamente utilizzando un tubo fotomoltiplicatore. I risultati ottenuti vengono convertiti in un istogramma.

La citometria a flusso viene utilizzata per determinare lo stato immunitario (contenuto delle principali popolazioni di linfociti, contenuto di citochine intracellulari ed extracellulari, attività funzionale delle cellule NK, attività di fagocitosi, ecc.).

Reazioni immunitarie. Applicazione delle reazioni immunitarie nella diagnosi delle malattie infettive.

PIANO:

Tipi di reazioni immunitarie.

Condizioni per condurre reazioni sierologiche.

Requisiti del siero.

Il concetto di risultati positivi e negativi.

CONTENUTI PRINCIPALI:

Tipi di reazioni immunitarie.

Reazione immunologica – Questa è l'interazione di un antigene con un anticorpo, che è determinata dall'interazione specifica dei centri attivi dell'anticorpo (paratopo) con gli epitopi degli antigeni.

Classificazione generale delle reazioni immunologiche:

reazioni sierologiche – reazioni tra antigeni (Ag) e anticorpi (Ig)

in vitro ;

reazioni cellulari con la partecipazione di cellule immunocompetenti;

test allergici – rilevamento di ipersensibilità.

Reazioni sierologiche: 1) definizione, 2) fasi, 3) obiettivi, 4) classificazione generale.

1) Definizione

Metodi di ricerca sierologica (dal latino Serum - siero e logos - studio) utilizzando la reazione antigene-anticorpo.

2) Fasi

2 fasi di interazione:

IO. Specifica (visibile) – avviene rapidamente, gli anticorpi si combinano con i loro antigeni corrispondenti. Durante questa fase interagiscono i gruppi determinanti degli antigeni (AG) e i centri attivi degli anticorpi (AT).

Le forze coinvolte nella formazione del complesso AG+AT sono:

pendente;

van der Waals

Legami di idrogeno.

Non ci sono cambiamenti visibili in questa fase. La microscopia elettronica mostra il complesso AG+AT sotto forma di reticolo.

II. Non specifico – avviene lentamente, il complesso antigene-anticorpo risultante reagisce con un ulteriore fattore ambientale non specifico in cui avviene la reazione, e questo è visibile all’occhio – incollaggio, dissoluzione, scaglie di precipitazione, ecc. In presenza di un elettrolita, la carica diminuisce , la solubilità diminuisce, si formano conglomerati visibili, che precipitano (agglutinano).

3) Stabilire obiettivi :

a) per identificare l'antigene (anticorpo noto siero diagnostico):

b) per rilevare gli anticorpi (Ig) (l'antigene è noto-diagnosticum):

4) Classificazione generale reazioni sierologiche :

a) semplice (2 componenti: Ag+Ig):

Reazioni di agglutinazione dell'AR (con antigene corpuscolare);

Reazioni di precipitazione PR (con antigene solubile);

b) complesso (3 componenti: Ag+Ig+C);

c) utilizzando un tag.

Varianti delle reazioni di agglutinazione e precipitazione

Reazione di agglutinazione :

La reazione di agglutinazione (RA) è una reazione immunitaria dell'interazione di una sospensione di antigeni (eritrociti, batteri) con antigeni in soluzione fisiologica.

Durante l'agglutinazione, le particelle AT si uniscono per formare un sedimento flocculante.

La reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA) è un tipo di reazione di agglutinazione in cui viene utilizzato un anticorpo o antigene eritrocitario diagnostico (eritrociti con AT o AG adsorbiti sulla loro superficie).

I globuli rossi agiscono come trasportatori passivi in questa reazione.

La valutazione dei risultati dell’RPGA viene effettuata come segue:

- A reazione positiva i globuli rossi adesi passivamente ricoprono il fondo del foro a forma di U o di V con uno strato uniforme con bordi smerlati (“ombrello”);

- A reazione negativa (in assenza di agglutinazione), i globuli rossi si accumulano nella rientranza centrale del foro, formando un “bottone” compatto con bordi nettamente definiti.

Il test di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI) viene utilizzato nella diagnosi delle infezioni virali. Alcuni virus contengono sulla loro superficie una proteina chiamata emoagglutinina, che incolla insieme i globuli rossi. L'aggiunta di anticorpi antivirali specifici blocca l'emoagglutinina virale: non si verifica emoagglutinazione.

La reazione di emoagglutinazione indiretta (IRHA), o reazione di Coombs, viene utilizzata per determinare gli anticorpi incompleti. L'aggiunta di siero antiglobulina (AT contro Ig umane) migliora i risultati della reazione. RNGA viene utilizzato per determinare il fattore Rh.

Per eseguire una reazione di agglutinazione (RA), sono necessari tre componenti:

1) antigene (agglutinogeno) AG;

2) anticorpo(agglutinina) AT;

3) elettrolita (soluzione isotonica di cloruro di sodio).
Ag + AT + elettrolita = agglutinare

Agglutinazione (dal latino agglutinatio - incollaggio) - incollaggio di globuli (batteri, globuli rossi, ecc.) Da parte di anticorpi in presenza di elettroliti - cloruro di sodio.

L'AR si manifesta sotto forma di scaglie o sedimenti costituiti da corpuscoli (ad esempio batteri, globuli rossi) “incollati insieme” da anticorpi.

RA è utilizzato per:

Reazione di agglutinazione microbica diretta (RA).

In questa reazione, gli anticorpi (agglutinine) agglutinano direttamente gli antigeni corpuscolari (agglutinogeni).

Sono solitamente rappresentati da una sospensione di microrganismi inattivati (reazione di agglutinazione microbica).

Per determinare il tipo di microrganismi, utilizzareagglutinante diagnostica standard siero ( famoso AT ).

I più comuni sono l'AR lamellare (approssimativo) e l'AR espanso.

La piastra RA è posizionata sul vetro. Viene utilizzato come metodo accelerato per rilevare anticorpi o identificare microrganismi.

Componenti:

1. sieri agglutinanti diagnostici standard (AT);

2. coltura pura in studio dal paziente;

3. soluzione salina.

Nella coltura pura in studio, gli antigeni (AG) si presentano sotto forma di particelle (cellule microbiche, eritrociti e altri antigeni corpuscolari), che vengono incollati insieme da anticorpi e precipitano.

Esempio:

Messa in scena indicativo reazioni di agglutinazione (RA ) sul vetro allo scopo di identificare i batteri coliformi.

Applicare gocce su un vetrino:

1 dissenteria ;
2 -esima goccia: - siero agglutinante contro gli agenti patogenitifo ;

(1-2 sieri diagnostici)
3 -esima goccia: - soluzione salina (controllo).
Aggiungere ad ogni goccia la coltura batterica pura testata. Mescolata.

Risultato : positivo - presenza di scaglie agglutinate,
negativo - assenza di scaglie agglutinate
Conclusione:I batteri studiati sono agenti causali della febbre tifoide (sono stati determinati gli antigeni).

Per determinare l'AT nel siero del paziente (diagnosi sierologica), un microbico standarddiagnosticum , contenente sospensionefamoso microbi o i loro antigeniAG .

Determinazione dei gruppi sanguigni ABO (reazione di emoagglutinazione (HRA)) – agglutinano i globuli rossi.

Componenti della reazione:

1. AG (globuli rossi) sangue da test

2. AT (eritrotest - zolicloni)

Set di zolicloni:

Reagente anti-A del coliclone (rosa)

Reagente anti-B del coliclone (blu)

Reagente Tsoliklon anti-AV (incolore)

3. elettrolita (soluzione salina)

Tecnica di determinazione:

1 .

Una goccia (0,1 ml) di zolicone anti-A, anti-B e anti-AB viene applicata nei pozzetti della compressa (per il controllo).

Accanto a ciascuna goccia del reagente viene applicata una piccola goccia (0,05-0,01 ml) del sangue da analizzare.

Quindi una goccia di zoliclone viene miscelata con una goccia di sangue utilizzando una bacchetta di vetro pulita.

La reazione di agglutinazione si sviluppa durante i primi 3-5 secondi quando la piastra viene oscillata leggermente.

I risultati della reazione vengono presi in considerazione 2,5 - 3 minuti dopo la miscelazione delle gocce. Da sinistra a destra nei pozzetti ci sono anti-A, anti-B, anti-AB.

Un risultato positivo è la comparsa di un sedimento granulare (agglutinato).

RA positivo (+)

Negativo: nessun sedimento.

RA negativo(-)

Analisi dei risultati.

O(IO) α β – nessuna agglutinazione

UN(II) β – agglutinazione con anti-A

B(III) α – agglutinazione con anti-B

AB(IV)O – agglutinazione con anti-A, con anti-B

Rappresentazione schematica dell'agglutinazione.

Antigeni Ag sugli eritrociti (rilevabili) + anticorpoA(zoliclon) siero diagnostico

Contabilità dell'agglutinazione nelle compresse

Reazione di precipitazione:

La reazione di precipitazione è una reazione immunitaria dell'interazione dell'antigene in uno stato solubile con l'antigene in una soluzione fisiologica.

Durante la precipitazione si forma un complesso immunitario macromolecolare, che si manifesta con la transizione di una soluzione colloidale trasparente in una sospensione opaca o precipitato.

La quantità di entrambi i reagenti deve essere in proporzioni rigorosamente definite, poiché un eccesso di uno di essi riduce il risultato.

Esistono vari modi per eseguire la reazione di precipitazione.

1. La reazione di precipitazione ad anello viene effettuata in tubi di precipitazione di piccolo diametro. Il siero immunitario viene aggiunto alla provetta e l'antigene solubile viene accuratamente stratificato. AG e AT si mescolano a causa del movimento termico delle molecole e interagiscono. Se il risultato è positivo, all'interfaccia delle due soluzioni si forma un anello di precipitato opaco.

2. La reazione di doppia immunodiffusione di Ouchterlony viene effettuata in un gel di agar, nei cui pozzetti viene aggiunta una soluzione AG o una soluzione AT secondo lo schema. AG e AT diffondono nel gel l'uno verso l'altro e, se la reazione è positiva, formano immunocomplessi visibili come linee di precipitazione.

Reazione alle precipitazioni –questa è la formazionee la precipitazione del complesso molecolare solubile antigene-anticorpo come una nuvola chiamata precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti.

Componenti dell'AR:

siero precipitante (noto AT-precipitina);

siero del test (antigene precipitinogeno sconosciuto);

fisico Soluzione.

La reazione di precipitazione viene effettuata in speciali provette strette (reazione di precipitazione ad anello) o in piastre Petri in gel, mezzi nutritivi, ecc.

Reazione di precipitazione dell'anello

Dichiarazione e registrazione dei risultati della reazioneprecipitazione ad anelloper individuare l'agente eziologico dell'antrace (reazione di Ascoli).

Messa in scena .

1. Il materiale in esame (pelle, lana, feltro, setole, stoffa, carne, terra, feci animali, ecc.) viene fatto bollire in soluzione salina per 5-45 minuti. per ottenere un estratto isotonico (estratto). Filtrato.

2. Il siero anti-antrace precipitante viene versato in una provetta.

3. Stratificare con cura il materiale di prova (estratto).

Contabilità .

Entro i prossimi 10 minuti. Nei casi positivi, appare un anello di torbidità all'interfaccia tra siero ed estratto (precipitazione dell'anello). La reazione dell'Ascoli è molto sensibile e specifica

Con il suo aiuto, è possibile identificare rapidamente i materiali infetti dall'antrace.

Reazione di precipitazione in agar

Dichiarazione e registrazione dei risultatiReazioni di precipitazione in agarper determinare la tossigenicità dei corinebatteri (agenti causativi della difterite)

Messa in scena

Posizionato su agar fosfato-peptone in una capsula Petri.

1. Posizionare una striscia di carta da filtro sterile inumidita lungo il centro della tazza.siero antitossico.

2. Dopo l'essiccazione, ad una distanza di 1 cm dal bordo della striscia, vengono seminate placche del diametro di 10 mmcolture selezionate.

In una tazza puoi seminare da 3 a 10 raccolti di cui unocontrollo, deve essere conosciutotossigenico.

I raccolti vengono posti in un termostato.

Contabilità

L'analisi viene effettuata dopo 24-48-72 ore.

Risultato positivo - (culturatossigenico) - ad una certa distanza dalla striscia di carta compaionolinee di precipitato, « frecce a viticcio", che sono chiaramente visibili nella luce trasmessa.

La figura mostra la reazione di precipitazione in agar per determinare la tossigenicità dei bacilli difterici. Le colture medie non hanno formato “viticci a freccia”; questi non sono agenti patogeni tossicogeni.

I ceppi dell'agente eziologico della difterite possono essere tossigeni (producendo esotossina) e non tossigeni. La formazione di un'esotossina dipende dalla presenza nei batteri di un profago portatore di un gene tox che codifica per la formazione di un'esotossina.

In caso di malattia, tutti gli agenti patogeni della difterite vengono testati per la tossigenicità - produzione di esotossina difterica utilizzando la reazione di precipitazione nell'agar

Reazioni sierologiche complesse ( 3 componenti: Ag+Ig+C):

Reazione di fissazione del complemento (CFR).

La reazione viene effettuata in due fasi.

Nella prima fase, l'AT interagisce con l'antigene e il complemento, nella seconda fase viene aggiunto un indicatore: il sistema emolitico (una miscela di globuli rossi e siero antieritrocitario).

Se il risultato è positivo, nella prima fase gli anticorpi formano con gli antigeni un immunocomplesso che lega il complemento della miscela di reazione.

In questo caso i globuli rossi del sistema emolitico aggiunti nella seconda fase non vengono distrutti.

Altrimenti, il complemento non legato causa la lisi dei globuli rossi indicatori.

Per realizzarlo sono necessari cinque ingredienti: AG, AT e complemento (primo sistema), eritrociti di pecora e siero emolitico (secondo sistema) (Fig. 1).

La reazione avviene in due fasi (Fig. 3).

Prima fase - interazione di antigene e anticorpi con la partecipazione obbligatoria del complemento.

Secondo - identificazione dei risultati della reazione utilizzando un sistema emolitico indicatore (globuli rossi di pecora e siero emolitico). La distruzione dei globuli rossi da parte del siero emolitico avviene solo se al sistema emolitico viene aggiunto il complemento. Se il complemento è stato precedentemente adsorbito sul complesso antigene-anticorpo, non si verifica l'emolisi degli eritrociti (Fig.).

Risultato dell'esperienza valutato (Fig. 2), rilevando la presenza o l'assenza di emolisi in tutte le provette. La reazione è considerata positiva quando l'emolisi è completamente ritardata, quando il liquido nella provetta è incolore e i globuli rossi si depositano sul fondo, negativa - quando i globuli rossi sono completamente lisati, quando il liquido è intensamente colorato (sangue "vernice" ).

Il grado di ritardo dell'emolisi viene valutato in base all'intensità del colore del liquido e alla dimensione del sedimento di globuli rossi sul fondo (++++, +++, ++, +).

Riso. 4. Rendiconto e risultato della RSC.

Conclusione:Nel siero del test sono stati rilevati anticorpi.

RSK consente di rilevare gli anticorpi contro qualsiasi ceppo dello stesso sierotipo del virus.

Il valore diagnostico ha:

un aumento di quattro volte del titolo anticorpale in sieri accoppiati (durante un'epidemia di influenza);

un duplice aumento del siero sanguigno dei pazienti con un quadro clinico caratteristico.

Reazioni utilizzando un tag :

Questi metodi sono altamente sensibili. Coloranti, isotopi radioattivi, enzimi, ecc. vengono utilizzati come etichette per antigeni o anticorpi.

RIF – reazione di immunofluorescenza

La reazione di immunofluorescenza si basa sull'indicazione luminosa del complesso antigene-anticorpo

Saggio immunoassorbente collegato.

Un moderno test di laboratorio che ricerca anticorpi specifici nel sangue o antigeni di malattie specifiche al fine di identificare non solo l'eziologia, ma anche lo stadio della malattia.

I risultati ELISA possono essere forniti qualitativamente e quantitativamente.

Attualmente, l'ELISA viene utilizzato nelle seguenti situazioni:

1) ricerca di anticorpi specifici contro qualsiasi malattia infettiva;

2) ricerca di antigeni di eventuali malattie (infettive, venereologiche);

3) studio dello stato ormonale del paziente;

4) esame dei marcatori tumorali;

5) esame per la presenza di malattie autoimmuni.

Nella figura, l'ELISA in fase solida mostra antigeni noti (a sinistra) adsorbiti su un pozzetto di una piastra, (a destra) su pozzetti di una piastra antigeni noti

Vantaggi del metodo ELISA:

1) Elevata specificità e sensibilità del metodo ELISA (oltre il 90%).

2) La capacità di determinare la malattia e tracciare la dinamica del processo, cioè confrontando il numero di anticorpi in diversi periodi di tempo.

3) Disponibilità della diagnostica ELISA in qualsiasi istituzione medica.

Svantaggio relativo: rilevamento di una risposta immunitaria (anticorpi), ma non dell'agente patogeno stesso, coniugato a un enzima tag.

Test ELISA (meccanismo generale):

La base del test immunoenzimatico è la reazione immunitaria dell'antigene e dell'anticorpo con la formazione di un complesso immunitario: antigene-anticorpo, che determina un cambiamento nell'attività enzimatica di segni specifici sulla superficie degli anticorpi.

Componenti della reazione:

1. AG(AT) noto - sul pozzetto della compressa.

2. AT (AG) in fase di studio.

3. AT con enzima, specifico del complesso AT(AG)-AG(AT).

4. substrato cromogenico che interagisce con l'enzima

5. interrompere la soluzione

Principali fasi dell'ELISA

1. Sulla superficie dei pozzetti della piastra è presente un antigene purificato di un agente patogeno specifico. Ad essi viene aggiunto il materiale biologico del paziente e tra questo antigene e l'anticorpo desiderato (immunoglobulina) avviene una reazione specifica. Si forma un complesso.

2. Viene aggiunto un coniugante – AT con l'enzima. Il coniugante è specifico per il complesso AT-AG del primo stadio. L'enzima è attivato.

3. Viene aggiunto il substrato e l'enzima attivo reagisce con esso, modificando il colore incolore della soluzione.

4. Viene aggiunta una soluzione di arresto per interrompere l'interazione enzima-substrato.

Contabilità.

Un risultato positivo è un cambiamento di colore, giallo nell'immagine.

Analisi immunocromatografica

Il metodo di analisi immunocromatografica (ICA, test rapidi) è un metodo di screening preliminare di alta qualità che consente di eseguire rapidamente, in pochi minuti, analisi in qualsiasi condizione, incl. "campo".

I vantaggi dell’ICA includono:

Velocità e facilità d'uso;

Piccoli volumi di campione, mancanza di preparazione del campione;

Economicità per il produttore e il consumatore;

Possibilità di produrre test in grandi volumi;

Facilità di lettura e interpretazione del risultato;

Elevata sensibilità e riproducibilità;

Possibilità di determinazione quantitativa;

Possibilità di utilizzare lettori portatili compatibili con un computer;

Possibilità di multianalisi.

Componenti (applicati sulla striscia reattiva):

1. Il coniugato con etichetta in oro colloidale è specifico per l'antigene rilevato.

2. Linea di test AT – specifica per il complesso AT-AG

3. Gli addominali della linea di controllo sono specifici del coniugato.

Impostazione ICA:

1.Applicare il campione sull'area iniziale designata della striscia.

2. Ottenere il risultato sotto forma di strisce colorate al posto delle linee di test e di controllo.

Contabilità

Positivo – quando la linea del test è colorata.

Negativo - se non è presente alcuna colorazione sulla linea del test.

Non valido – se la linea di controllo non è colorata.

Meccanismo generale dell’ICA:

1. Il campione viene introdotto nel campo iniziale (tampone del campione) ed è associato al coniugato (un corpo specifico con un'etichetta colorata), che si trova sul tampone del coniugato. Di conseguenza, si forma un complesso colorato.

2. Il complesso immunitario colorato risultante si muove sotto l'azione delle forze capillari lungo la membrana di nitrocellulosa E interagiscecon linea di prova AT.Il risultato è un'unica striscia colorata rosa-rossa.

3. AT (coniugato) non legato alla banda testatasi sposta oltre e raggiunge la linea di controllo, comunica con l'AT della linea di controllo.Di conseguenza appare una seconda striscia colorata.Se l'analisi viene eseguita correttamente, la linea di Controllo dovrebbe sempre apparire, indipendentemente dalla presenza dell'antigene (anticorpo) del test nel campione di fluido biologico.

2. Condizioni per condurre reazioni sierologiche.

1. La presenza di omologhi - corrispondenti tra loro antigene e anticorpo.

2. Piatti puliti e asciutti.

3. Un certo rapporto tra farmaci (il più delle volte uguale).

4. Presenza obbligatoria di un elettrolita (soluzione isotonica di NaCl).

5. pH neutro o quasi leggermente alcalino.

6. Temperatura +37°C o temperatura ambiente (necessariamente positiva).

7. Vengono eseguiti il controllo dell'antigene e il controllo del siero (anticorpo).

3 Requisiti del siero

Il siero deve essere completamente trasparente senza alcuna mescolanza di cellule.

Di solito lo ricevono alla 2a settimana di malattia, quando gli anticorpi sono già disponibili.

Il sangue viene prelevato in una quantità di 3-5 ml a stomaco vuoto o 6 ore dopo un pasto.

Per ottenere il siero, il sangue viene lasciato per 1 ora a temperatura ambiente o centrifugato. Il siero viene aspirato con molta attenzione per non catturare gli elementi formati.

I sieri immunitari sono ottenuti dal sangue di persone o animali (solitamente conigli e cavalli), immunizzati secondo un determinato schema con l'antigene corrispondente (vaccino). I sieri vengono solitamente preparati durante la produzione.

4. Il concetto di risultati positivi e negativi.

RA.

Con una reazione positiva, i globuli rossi incollati passivamente coprono il fondo del foro in uno strato uniforme con bordi smerlati (“ombrello”); in assenza di agglutinazione, i globuli rossi si accumulano nel recesso centrale del foro, formando un “bottone” compatto con bordi ben definiti (vedi immagini sopra).

RP.

Se il risultato è positivo, si forma un anello lattiginoso all'interfaccia delle due soluzioni (vedi immagini sopra).

ELISA.

Un cambiamento nel colore della soluzione avviene con una reazione positiva.

RSK.

Emolisi ritardata: la reazione è positiva; se il complemento è libero, si osserva emolisi: la reazione è negativa(vedi foto sopra).

Risultati della reazione Wasserman:

a - ritardo completo dell'emolisi (+ + ++);

b - ritardo pronunciato nell'emolisi (+ ++);

c - ritardo parziale dell'emolisi (++);

d - leggero ritardo nell'emolisi (+);

d - emolisi completa (-).

La reazione è positiva con ritardo parziale, pronunciato e completo dell'emolisi, determinato dal grado di colorazione del contenuto delle provette dal rosa chiaro al rosso vivo; gli eritrociti non emolizzati formano successivamente un precipitato rosso.

Compiti a casa:

1. Studia il materiale

Prendi 3 appunti sul video

I metodi di ricerca immunologica sono metodi di ricerca diagnostica basati sull'interazione specifica di antigeni e anticorpi. Ampiamente usato per:

Determinazione dei gruppi sanguigni, degli antigeni tissutali e tumorali,

Specie proteiche,

Riconoscere le allergie e le malattie autoimmuni,

Gravidanza,

Disturbi ormonali, così come

Nel lavoro di ricerca.

Includono studi sierologici o reazioni sierologiche, che di solito includono reazioni di esposizione diretta ad antigeni e anticorpi del siero del sangue in vitro. I metodi immunologici sono ampiamente utilizzati nella diagnosi di laboratorio delle malattie infettive. L'eziologia della malattia viene stabilita anche in base all'aumento degli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue convalescente rispetto ad un campione prelevato nei primi giorni della malattia. Basato su I.m. e. studiare l'immunità della popolazione alle infezioni di massa, come l'influenza, e valutare anche l'efficacia delle vaccinazioni preventive.

REAZIONI DI AGLUTINAZIONE. L'agglutinazione è l'incollaggio di cellule o singole particelle che trasportano un antigene con l'aiuto del siero immunitario a questo antigene.

La reazione di agglutinazione batterica utilizzando l'apposito siero antibatterico è una delle reazioni sierologiche più semplici. Una sospensione di batteri viene aggiunta a varie diluizioni del siero sanguigno in esame e dopo un certo tempo di contatto a t°37° si registra a quale diluizione più alta si verifica l'agglutinazione del siero sanguigno. La reazione di agglutinazione batterica viene utilizzata per diagnosticare molte malattie infettive: brucellosi, tularemia, febbre tifoide e paratifoide, dissenteria bacillare, tifo.

Le reazioni di agglutinazione per determinare il gruppo sanguigno e il fattore Rh si basano sull'interazione di alloanticorpi (isoanticorpi) e antigeni eritrocitari.

Reazione di emoagglutinazione passiva o indiretta (RPHA, RNHA). Utilizza globuli rossi o materiali sintetici neutri (ad esempio particelle di lattice), sulla cui superficie vengono assorbiti antigeni (batterici, virali, tissutali) o anticorpi. La loro agglutinazione avviene quando vengono aggiunti sieri o antigeni appropriati. La reazione di emoagglutinazione passiva viene utilizzata per diagnosticare malattie causate da batteri (febbre tifoide e paratifoide, dissenteria, brucellosi, peste, colera, ecc.), protozoi (malaria) e virus (influenza, infezioni adenovirus, epatite virale B, morbillo, zecca). encefalite trasmessa, febbre emorragica di Crimea, ecc.), nonché per determinare alcuni ormoni, per identificare l'ipersensibilità del paziente a farmaci e ormoni, come la penicillina e l'insulina.

La reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI) si basa sul fenomeno del siero immunitario che previene (inibisce) l'emoagglutinazione degli eritrociti da parte dei virus e viene utilizzata per rilevare e titolare gli anticorpi antivirali. Serve come metodo principale per la sierodiagnosi dell'influenza, del morbillo, della rosolia, della parotite, dell'encefalite trasmessa dalle zecche e di altre infezioni virali, i cui agenti causali hanno proprietà emoagglutinanti.

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