Metodi di determinazione biologici e biochimici. Metodi di ricerca biochimica. Metodo di studio biochimico: metodi

A differenza del metodo citogenetico, che consente di studiare normalmente la struttura dei cromosomi e del cariotipo e di diagnosticare malattie ereditarie associate a cambiamenti nel loro numero e all'interruzione dell'organizzazione, malattie ereditarie causate da mutazioni genetiche, nonché polimorfismo in cellule primarie normali i prodotti genetici, vengono studiati utilizzando metodi biochimici.

Questi metodi furono utilizzati per la prima volta per diagnosticare le malattie genetiche all’inizio del XX secolo. Negli ultimi 30 anni sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca di nuove forme di alleli mutanti. Con il loro aiuto sono state descritte più di 1000 malattie metaboliche congenite. Per molti di loro è stato identificato un difetto nel prodotto genetico primario. Le più comuni tra queste malattie sono le malattie associate a difetti negli enzimi, nelle proteine ​​strutturali, di trasporto o di altro tipo.

I difetti nelle proteine ​​strutturali e circolanti vengono identificati studiando la loro struttura. Quindi, negli anni '60. XX secolo È stata completata l'analisi della catena 3-globina dell'emoglobina, composta da 146 residui di aminoacidi. È stata stabilita un'ampia varietà di emoglobine nell'uomo, associata a cambiamenti nella struttura delle sue catene peptidiche, che spesso è la causa dello sviluppo delle malattie (vedi § 4.1).

I difetti enzimatici vengono determinati determinando il contenuto dei prodotti metabolici nel sangue e nelle urine che sono il risultato del funzionamento di questa proteina. Una carenza del prodotto finale, accompagnata dall'accumulo di prodotti intermedi e sottoprodotti del metabolismo compromesso, indica un difetto o una carenza enzimatica nell'organismo (vedere § 4.1).

La diagnosi biochimica dei disordini metabolici ereditari viene effettuata in due fasi. Nella prima fase vengono selezionati i casi presunti di malattia, nella seconda la diagnosi della malattia viene chiarita utilizzando metodi più accurati e complessi. L'uso di studi biochimici per diagnosticare malattie nel periodo prenatale o immediatamente dopo la nascita consente di identificare tempestivamente la patologia e avviare misure mediche specifiche, come, ad esempio, nel caso della fenilchetonuria.

Per determinare il contenuto di intermedi, sottoprodotti e prodotti metabolici finali nel sangue, nelle urine o nel liquido amniotico, oltre alle reazioni qualitative con reagenti specifici per determinate sostanze, vengono utilizzati metodi cromatografici per lo studio degli amminoacidi e altri composti.

La causa di numerosi disturbi metabolici ereditari sono vari difetti enzimatici che derivano da mutazioni nei geni corrispondenti. Tali malattie sono chiamate enzimopatia (enzimopatie). I più comuni sono la fenilchetonuria, l'alcaptonuria, la galattosemia, la fibrosi cistica, la malattia di Gaucher, la malattia di Tay-Sachs, l'albinismo, ecc. Gli indicatori biochimici (prodotto genetico primario, accumulo di metaboliti patologici nel corpo del paziente) riflettono più chiaramente l'essenza della malattia rispetto alle indicazioni cliniche.

Uso della cromatografia, elettroforesi, spettroscopia, ecc. consente di determinare eventuali metaboliti specifici di una particolare malattia ereditaria.

Cromatografia è un metodo per separare varie miscele nei loro componenti. Il metodo prevede che in un mezzo stazionario attraverso il quale scorre un solvente, ciascun componente da esso catturato si muova ad una certa velocità, indipendentemente dalla velocità degli altri componenti. Se, ad esempio, una miscela di pigmenti che determinano il colore verde di una pianta viene sciolta in un determinato solvente e fatta passare attraverso un mezzo fisso, ad esempio attraverso il gesso macinato, si separerà in diversi pigmenti diversi. Lo stesso principio viene utilizzato per determinare la presenza di un determinato enzima in una miscela complessa di varie sostanze presenti nell'organismo.

Elettroforesi - Questa è una modifica della cromatografia che consente di separare molecole con cariche diverse. In un ambiente cromatografico, sotto l'influenza di un campo elettrico, varie molecole della miscela si muovono in una direzione o nell'altra a seconda delle loro masse e cariche relative. L'elettroforesi è ampiamente utilizzata per l'isolamento e l'identificazione degli amminoacidi.

Spettroscopia consiste nel determinare la struttura delle molecole di varie sostanze utilizzando strumenti speciali: gli spettroscopi. A seconda del tipo di dispositivo, la spettroscopia viene eseguita nelle parti dello spettro ultravioletto, visibile o infrarosso. La luce viene fatta passare attraverso la sostanza in esame e il suo spettro di uscita viene analizzato. Ogni elemento chimico ha linee caratteristiche nello spettro, quindi è possibile determinare la struttura chimica della molecola della sostanza in studio. In questo modo viene identificato un enzima specifico o un altro composto chimico presente nell'organismo oppure viene determinata la struttura di una sostanza precedentemente sconosciuta.

Gli oggetti delle analisi biochimiche possono essere urina, sudore, plasma e cellule del sangue, colture cellulari (fibroblasti, linfociti).

Metodi biochimici - determinazione della presenza di determinate sostanze (principalmente prodotti genetici primari - enzimi e metaboliti patologici allo scopo di diagnosticare malattie ereditarie).

I metodi biochimici richiedono molta manodopera e richiedono attrezzature speciali, quindi non possono essere utilizzati per studi sulla popolazione di massa allo scopo di individuare precocemente pazienti con patologie metaboliche ereditarie. Recentemente sono stati sviluppati programmi speciali e utilizzati per la ricerca di massa in diversi paesi. Si chiama la prima fase di tale programma selezione(English Screening - sifting), che consiste nell'identificare tra un gran numero di pazienti esaminati che potrebbero avere alcune deviazioni ereditarie dalla norma. In questa fase, vengono solitamente utilizzati metodi rapidi semplici e accessibili per identificare i prodotti metabolici nelle urine e nel sangue. Nella seconda fase una precisazione(conferma o confutazione della diagnosi) utilizzando metodi cromatografici precisi per la determinazione di enzimi, aminoacidi, ecc.

Vengono utilizzati anche test microbiologici, basati sul fatto che alcuni ceppi di batteri crescono solo in terreni contenenti determinati aminoacidi e carboidrati. Se nel sangue o nelle urine è presente una sostanza necessaria alla crescita, in una capsula di Petri attorno alla carta da filtro imbevuta di uno di questi liquidi si osserva una crescita attiva di batteri, cosa che non avviene nel caso di analisi del sangue o delle urine di una persona sana.

Metodi biochimici vengono utilizzati anche per identificare i portatori eterozigoti di anomalie ereditarie, il cui fenotipo non è chiaro. Questo viene fatto utilizzando test biochimici, esami microscopici di cellule del sangue e tessuti, determinando l'attività di un determinato enzima modificato a seguito di una mutazione e simili. Tali misure sono necessarie per il trattamento e la prevenzione tempestivi, nonché per determinare la probabilità di avere un figlio malato in una famiglia geneticamente a rischio.

Metodo genetico molecolare

Il metodo della genetica molecolare consente di analizzare frammenti di DNA, trovare e isolare singoli geni e i loro segmenti e determinare la sequenza nucleotidica in essi.

Metodo genetico molecolare - l'uso di reazioni biochimiche, che vengono effettuate utilizzando enzimi appropriati, per determinare la struttura dei geni, la loro identificazione e localizzazione, nonché la natura delle mutazioni.

Questo metodo viene utilizzato con successo per identificare le mutazioni genetiche e per studiare il genoma umano. Si diffuse negli anni 70-80 del XX secolo. in connessione con lo sviluppo della genetica molecolare.

La fase iniziale dell'analisi genetica molecolare consiste nell'ottenere un numero sufficiente di campioni di DNA attraverso la clonazione. A questo scopo viene utilizzato il DNA genomico: l'intero DNA di una cellula o i suoi singoli frammenti.

La despiralizzazione, l'identificazione e il taglio dei frammenti di DNA corrispondenti vengono effettuati utilizzando enzimi speciali - resrictasi. Diversi enzimi di restrizione riconoscono solo le sequenze nucleotidiche corrispondenti e tagliano il DNA in punti specifici. Frammenti di DNA isolati utilizzando enzimi speciali - polimerasi- copie nella quantità richiesta.

I frammenti di DNA copiati vengono separati in frazioni dimensionali mediante elettroforesi su agar o gel di poliacridamide. Sotto l'influenza di un campo elettrico, i frammenti di DNA si muovono nel gel ad una velocità che dipende dalla loro lunghezza: più sono corti, più velocemente si muovono. Di conseguenza, i frammenti di DNA dopo un certo tempo occupano un certo posto sulla striscia di gel sotto forma di bande separate. La lunghezza di ciascun frammento viene determinata confrontando le distanze percorse da esso e un pezzo standard di DNA (con dimensioni e sequenza di basi note).

Per identificare i frammenti di DNA isolati, questi vengono prima separati in due filamenti e poi ibridati con i corrispondenti frammenti di DNA marcatore. Se ciò si traduce nella formazione di una doppia elica normale, allora il frammento in studio non presentava anomalie. Se l'elica presenta difetti, il frammento studiato è mutante.

Varie modifiche di questo metodo permettono di analizzare in laboratorio anche una piccola quantità di DNA prelevato da un paziente. sono utilizzati per la diagnosi prenatale delle malattie ereditarie. In questo caso il DNA è ottenuto da cellule contenute nel liquido amniotico. Un embrione anomalo è facile da riconoscere perché il suo DNA si ibrida solo con un frammento di DNA marcatore che ha una sequenza nucleotidica mutante complementare.

Negli anni '90 del XX secolo. Utilizzando tecniche di genetica molecolare, sono stati identificati e localizzati i geni responsabili di gravi malattie ereditarie del sistema nervoso umano come la corea di Huntington, la distrofia miotonica, la sindrome dell'X fragile, ecc .. Ad esempio, il gene della corea di Huntington è localizzato nel braccio corto del 4° cromosoma. Presenta una sezione in cui la sequenza nucleotidica è rappresentata da ripetizioni multiple delle tre basi CAG (citosina - adenina - guanina). Normalmente, il numero di tali ripetizioni varia da 11 a 34, e nei pazienti a causa di una mutazione genetica ce ne sono 37-86. La malattia viene ereditata con modalità autosomica dominante e il tratto si manifesta in tutti i portatori del gene.

Basandosi sul metodo della genetica molecolare, vengono attualmente sviluppate con successo tecnologie di terapia genica per malattie ereditarie comuni, come la fibrosi cistica.

Il metodo biochimico per studiare la genetica umana si basa sullo studio della natura delle reazioni biochimiche nel corpo e del metabolismo per stabilire la presenza di un gene anormale o chiarire la diagnosi.
A differenza del metodo citogenetico, che consente di studiare normalmente la struttura dei cromosomi e del cariotipo e di diagnosticare malattie ereditarie associate a cambiamenti nel loro numero e all'interruzione dell'organizzazione, malattie ereditarie causate da mutazioni genetiche, nonché polimorfismo in cellule primarie normali i prodotti genetici, vengono studiati utilizzando metodi biochimici.
Questi metodi permettono di determinare la posizione e la natura della mutazione mediante cambiamenti nella composizione delle proteine ​​interessate dalla mutazione. Ad esempio, quando una mutazione porta alla sostituzione di un solo amminoacido nell'enorme molecola del portatore di ossigeno, l'emoglobina, si verifica una malattia ereditaria chiamata anemia falciforme, in cui i globuli rossi assumono la forma di una mezzaluna. Esaminando la composizione aminoacidica dell'emoglobina e rilevando una sostituzione, puoi immediatamente fare una diagnosi.
Questi metodi furono utilizzati per la prima volta per diagnosticare le malattie genetiche all’inizio del XX secolo. Negli ultimi 30 anni sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca di nuove forme di alleli mutanti. Con il loro aiuto sono state descritte più di 1000 malattie metaboliche congenite. Per molti di loro è stato identificato un difetto nel prodotto genetico primario. Le più comuni tra queste malattie sono le malattie associate a difetti negli enzimi, nelle proteine ​​strutturali, di trasporto o di altro tipo. È stata stabilita un'ampia varietà di emoglobine nell'uomo, che è associata a cambiamenti nella struttura delle sue catene peptidiche, che spesso sono la causa dello sviluppo di malattie. I difetti enzimatici vengono determinati determinando il contenuto dei prodotti metabolici nel sangue e nelle urine che sono il risultato del funzionamento di questa proteina. La carenza del prodotto finale, accompagnata dall'accumulo di prodotti intermedi e sottoprodotti del metabolismo compromesso, indica un difetto o una carenza enzimatica nel corpo.
Oggetto della moderna diagnostica biochimica sono metaboliti specifici, enzimopatie e varie proteine. Gli oggetti dell'analisi biochimica possono essere urina, sudore, plasma e siero, cellule del sangue, colture cellulari (fibroblasti, linfociti). Per la diagnostica biochimica vengono utilizzate sia semplici reazioni qualitative (ad esempio, cloruro ferrico per rilevare la fenilchetonuria) sia metodi più accurati.
La diagnosi biochimica dei disordini metabolici ereditari viene effettuata in due fasi. Nella prima fase vengono selezionati i casi presunti di malattia, nella seconda fase la diagnosi della malattia viene chiarita utilizzando metodi più accurati e complessi. L'uso di studi biochimici per diagnosticare malattie nel periodo prenatale o immediatamente dopo la nascita consente di identificare tempestivamente la patologia e avviare misure mediche specifiche, come, ad esempio, nel caso della fenilchetonuria. Per determinare il contenuto di intermedi, sottoprodotti e prodotti metabolici finali nel sangue, nelle urine o nel liquido amniotico, oltre alle reazioni qualitative con reagenti specifici per determinate sostanze, vengono utilizzati metodi cromatografici per lo studio degli amminoacidi e altri composti.
I metodi biochimici per lo studio dell'eredità umana aiutano a rilevare una serie di malattie metaboliche (carboidrati, amminoacidi, lipidi, ecc.) Utilizzando, ad esempio, lo studio dei fluidi biologici attraverso analisi qualitative o quantitative.
Utilizzando metodi biochimici sono state scoperte circa 500 malattie molecolari derivanti dalla manifestazione di geni mutanti. In vari tipi di malattie è possibile determinare l'enzima proteico anomalo stesso o identificare i prodotti metabolici intermedi. Sulla base dei risultati dei test biochimici, è possibile diagnosticare la malattia e determinare i metodi di trattamento. La diagnosi precoce e l'uso di varie diete nelle prime fasi dello sviluppo postembrionale possono curare alcune malattie o almeno alleviare la condizione dei pazienti con sistemi enzimatici difettosi.

Per la ricerca genetica, una persona è un oggetto scomodo, poiché negli esseri umani: l'incrocio sperimentale è impossibile; un gran numero di cromosomi; la pubertà arriva tardi; piccolo numero di discendenti in ciascuna famiglia; è impossibile eguagliare le condizioni di vita della prole.

Nella genetica umana vengono utilizzati numerosi metodi di ricerca.

Metodo genealogico

L'uso di questo metodo è possibile quando si conoscono parenti diretti: gli antenati del proprietario del tratto ereditario ( probando) in linea materna e paterna in più generazioni o anche i discendenti del probando in più generazioni. Quando si compilano alberi genealogici in genetica, viene utilizzato un determinato sistema di notazione. Dopo aver compilato il pedigree, viene analizzato per stabilire la natura dell'ereditarietà del tratto studiato.

Convenzioni adottate nella compilazione degli alberi genealogici:
1 - uomo; 2 - donna; 3: il sesso è sconosciuto; 4 - proprietario del tratto studiato; 5 - portatore eterozigote del gene recessivo studiato; 6 - matrimonio; 7 - matrimonio di un uomo con due donne; 8 - matrimonio consanguineo; 9 - genitori, figli e loro ordine di nascita; 10 - gemelli dizigoti; 11 - gemelli monozigoti.

Grazie al metodo genealogico sono stati determinati i tipi di eredità di molti tratti negli esseri umani. Pertanto, il tipo autosomico dominante eredita la polidattilia (aumento del numero di dita), la capacità di arricciare la lingua in un tubo, la brachidattilia (dita corte a causa dell'assenza di due falangi sulle dita), lentiggini, calvizie precoce, dita fuse, schisi labbro, palatoschisi, cataratta oculare, fragilità ossea e molti altri. L'albinismo, i capelli rossi, la predisposizione alla poliomielite, il diabete mellito, la sordità congenita e altri tratti sono ereditati come autosomici recessivi.

Il tratto dominante è la capacità di arrotolare la lingua fino a formare un tubo (1) e il suo allele recessivo è l'assenza di questa capacità (2).
3 - albero genealogico per polidattilia (ereditarietà autosomica dominante).

Numerosi tratti sono ereditati in modo legato al sesso: eredità legata all'X - emofilia, daltonismo; Legato a Y: ipertricosi del bordo del padiglione auricolare, dita palmate. Esistono numerosi geni localizzati in regioni omologhe dei cromosomi X e Y, ad esempio il daltonismo generale.

L'uso del metodo genealogico ha dimostrato che con un matrimonio imparentato, rispetto a un matrimonio non imparentato, la probabilità di deformità, nati morti e mortalità precoce nella prole aumenta in modo significativo. Nei matrimoni tra consanguinei, i geni recessivi spesso diventano omozigoti, provocando lo sviluppo di alcune anomalie. Un esempio di ciò è l'eredità dell'emofilia nelle case reali d'Europa.

- emofiliaco; - donna portatrice.

Metodo gemellare

1 - gemelli monozigoti; 2 - gemelli dizigoti.

I gemelli sono bambini nati nello stesso periodo. Sono monozigote(identico) e dizigotico(fraterno).

I gemelli monozigoti si sviluppano da uno zigote (1), che nella fase di scissione è diviso in due (o più) parti. Pertanto, tali gemelli sono geneticamente identici e sempre dello stesso sesso. I gemelli monozigoti sono caratterizzati da un elevato grado di somiglianza ( concordanza) per molte ragioni.

I gemelli dizigoti si sviluppano da due o più ovuli che sono stati simultaneamente ovulati e fecondati da spermatozoi diversi (2). Pertanto, hanno genotipi diversi e possono essere dello stesso sesso o di sesso diverso. A differenza dei gemelli monozigoti, i gemelli dizigoti sono caratterizzati da discordanza – dissomiglianza in molti modi. I dati sulla concordanza gemellare per alcune caratteristiche sono mostrati nella tabella.

Come si può vedere dalla tabella, il grado di concordanza dei gemelli monozigoti per tutte le caratteristiche sopra indicate è significativamente più alto di quello dei gemelli dizigoti, ma non è assoluto. Di norma, la discordanza nei gemelli monozigoti si verifica a causa di disturbi nello sviluppo intrauterino di uno di essi o sotto l'influenza dell'ambiente esterno, se era diverso.

Grazie al metodo gemello, è stata determinata la predisposizione ereditaria di una persona a una serie di malattie: schizofrenia, epilessia, diabete mellito e altre.

Le osservazioni dei gemelli monozigoti forniscono materiale per chiarire il ruolo dell'ereditarietà e dell'ambiente nello sviluppo dei tratti. Inoltre, l'ambiente esterno si riferisce non solo a fattori ambientali fisici, ma anche a condizioni sociali.

Metodo citogenetico

Basato sullo studio dei cromosomi umani in condizioni normali e patologiche. Normalmente, un cariotipo umano comprende 46 cromosomi: 22 paia di autosomi e due cromosomi sessuali. L'uso di questo metodo ha permesso di identificare un gruppo di malattie associate a cambiamenti nel numero di cromosomi o cambiamenti nella loro struttura. Tali malattie sono chiamate cromosomico.

Il materiale per l'analisi del cariotipo è molto spesso i linfociti del sangue. Il sangue viene prelevato da una vena negli adulti e da un dito, dal lobo dell'orecchio o dal tallone nei neonati. I linfociti vengono coltivati ​​in uno speciale mezzo nutritivo, che, in particolare, contiene sostanze aggiunte che "costringono" i linfociti a dividersi intensamente attraverso la mitosi. Dopo qualche tempo, alla coltura cellulare viene aggiunta la colchicina. La colchicina arresta la mitosi a livello della metafase. È durante la metafase che i cromosomi sono più condensati. Successivamente, le cellule vengono trasferite su vetrini, essiccate e colorate con vari coloranti. La colorazione può essere a) di routine (i cromosomi vengono colorati in modo uniforme), b) differenziale (i cromosomi acquisiscono striature incrociate, con ciascun cromosoma che ha un modello individuale). La colorazione di routine consente di identificare le mutazioni genomiche, determinare l'affiliazione di gruppo di un cromosoma e scoprire in quale gruppo è cambiato il numero di cromosomi. La colorazione differenziale consente di identificare le mutazioni cromosomiche, determinare il cromosoma in base al numero e scoprire il tipo di mutazione cromosomica.

Nei casi in cui è necessario condurre un'analisi cariotipica del feto, le cellule del liquido amniotico (liquido amniotico) - una miscela di cellule simili a fibroblasti ed epiteliali - vengono prelevate per la coltivazione.

Le malattie cromosomiche includono: sindrome di Klinefelter, sindrome di Turner-Shereshevsky, sindrome di Down, sindrome di Patau, sindrome di Edwards e altre.

I pazienti con sindrome di Klinefelter (47, XXY) sono sempre uomini. Sono caratterizzati da sottosviluppo delle gonadi, degenerazione dei tubuli seminiferi, spesso ritardo mentale e crescita elevata (a causa delle gambe sproporzionatamente lunghe).

La sindrome di Turner-Shereshevsky (45, X0) è stata osservata nelle donne. Si manifesta con pubertà ritardata, sottosviluppo delle gonadi, amenorrea (assenza di mestruazioni) e infertilità. Le donne con la sindrome di Turner-Shereshevskij sono basse, il loro corpo è sproporzionato - la parte superiore del corpo è più sviluppata, le spalle sono larghe, il bacino è stretto - gli arti inferiori sono accorciati, il collo è corto con pieghe, il "mongoloide" ” forma degli occhi e una serie di altri segni.

La sindrome di Down è una delle malattie cromosomiche più comuni. Si sviluppa come risultato della trisomia sul cromosoma 21 (47; 21, 21, 21). La malattia è facilmente diagnosticabile, poiché presenta una serie di segni caratteristici: arti accorciati, cranio piccolo, ponte nasale piatto e largo, rime palpebrali strette con un'incisione obliqua, presenza di una piega nella palpebra superiore, ritardo mentale. Spesso si osservano anche disturbi nella struttura degli organi interni.

Le malattie cromosomiche insorgono anche a causa di cambiamenti nei cromosomi stessi. Sì, cancellazione R-braccio dell'autosoma n. 5 porta allo sviluppo della sindrome del “grido del gatto”. Nei bambini con questa sindrome, la struttura della laringe è interrotta e nella prima infanzia hanno un peculiare timbro vocale "miagolante". Inoltre, vi è un ritardo dello sviluppo psicomotorio e della demenza.

Molto spesso, le malattie cromosomiche sono il risultato di mutazioni avvenute nelle cellule germinali di uno dei genitori.

Metodo biochimico

Consente di rilevare disturbi metabolici causati da cambiamenti nei geni e, di conseguenza, cambiamenti nell'attività di vari enzimi. Le malattie metaboliche ereditarie si dividono in malattie del metabolismo dei carboidrati (diabete mellito), del metabolismo degli aminoacidi, dei lipidi, dei minerali, ecc.

La fenilchetonuria è una malattia del metabolismo degli aminoacidi. La conversione dell'aminoacido essenziale fenilalanina in tirosina viene bloccata, mentre la fenilalanina viene convertita in acido fenilpiruvico, che viene escreto nelle urine. La malattia porta al rapido sviluppo della demenza nei bambini. La diagnosi precoce e la dieta possono fermare lo sviluppo della malattia.

Metodo statistico della popolazione

Questo è un metodo per studiare la distribuzione dei tratti ereditari (malattie ereditarie) nelle popolazioni. Un punto essenziale quando si utilizza questo metodo è l'elaborazione statistica dei dati ottenuti. Sotto popolazione comprendere un insieme di individui della stessa specie, che vivono per lungo tempo in un determinato territorio, si incrociano liberamente tra loro, hanno un'origine comune, una certa struttura genetica e, in un modo o nell'altro, isolati da altri simili insiemi di individui di una data specie. Una popolazione non è solo una forma di esistenza di una specie, ma anche un'unità di evoluzione, poiché i processi microevolutivi che culminano nella formazione di una specie si basano su trasformazioni genetiche nelle popolazioni.

Un ramo speciale della genetica si occupa dello studio della struttura genetica delle popolazioni - genetica delle popolazioni. Negli esseri umani si distinguono tre tipi di popolazioni: 1) panmittica, 2) demi, 3) isolati, che differiscono tra loro per numero, frequenza dei matrimoni intragruppo, proporzione di immigrati e crescita della popolazione. La popolazione di una grande città corrisponde a una popolazione panmittica. Le caratteristiche genetiche di qualsiasi popolazione includono i seguenti indicatori: 1) pool genico(la totalità dei genotipi di tutti gli individui di una popolazione), 2) frequenze genetiche, 3) frequenze genotipiche, 4) frequenze fenotipiche, sistema matrimoniale, 5) fattori che modificano le frequenze genetiche.

Per determinare la frequenza di comparsa di determinati geni e genotipi, viene utilizzato Legge di Hardy-Weinberg.

Legge di Hardy-Weinberg

In una popolazione ideale, di generazione in generazione, viene mantenuto un rapporto rigorosamente definito tra le frequenze dei geni dominanti e recessivi (1), nonché il rapporto tra le frequenze delle classi genotipiche degli individui (2).

Dove P— frequenza di comparsa del gene dominante A; Q— frequenza di comparsa del gene recessivo a; R 2 - frequenza di comparsa degli omozigoti per l'AA dominante; 2 pq— frequenza di comparsa degli eterozigoti Aa; Q 2 - frequenza di comparsa degli omozigoti per il recessivo aa.

La popolazione ideale è una popolazione panmittica (panmixia - incrocio libero) sufficientemente grande in cui non vi è alcun processo di mutazione, selezione naturale e altri fattori che disturbano l'equilibrio dei geni. È chiaro che le popolazioni ideali non esistono in natura; nelle popolazioni reali viene utilizzata la legge di Hardy-Weinberg con alcune modifiche.

La legge di Hardy-Weinberg, in particolare, viene utilizzata per approssimare il numero di portatori di geni recessivi per malattie ereditarie. Ad esempio, è noto che la fenilchetonuria si verifica con una frequenza di 1:10.000 in questa popolazione. La fenilchetonuria è ereditata con modalità autosomica recessiva, pertanto i pazienti con fenilchetonuria hanno il genotipo aa, cioè Q 2 = 0,0001. Da qui: Q = 0,01; P= 1 - 0,01 = 0,99. I portatori di un gene recessivo hanno il genotipo Aa, cioè sono eterozigoti. Frequenza di comparsa degli eterozigoti (2 pq) è 2 · 0,99 · 0,01 ≈ 0,02. Conclusione: in questa popolazione, circa il 2% della popolazione è portatore del gene della fenilchetonuria. Allo stesso tempo, puoi calcolare la frequenza di comparsa degli omozigoti per dominante (AA): P 2 = 0,992, poco meno del 98%.

Un cambiamento nell'equilibrio di genotipi e alleli in una popolazione panmittica avviene sotto l'influenza di fattori che agiscono costantemente, tra cui: processo di mutazione, ondate di popolazione, isolamento, selezione naturale, deriva genetica, emigrazione, immigrazione, consanguineità. È grazie a questi fenomeni che nasce un fenomeno evolutivo elementare: un cambiamento nella composizione genetica della popolazione, che è la fase iniziale del processo di speciazione.

La genetica umana è uno dei rami della scienza in più rapido sviluppo. È la base teorica della medicina e rivela le basi biologiche delle malattie ereditarie. La conoscenza della natura genetica delle malattie consente di effettuare una diagnosi accurata in tempo ed effettuare il trattamento necessario.

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Il metodo biochimico è considerato il metodo principale per la diagnosi qualitativa di varie malattie. Analizziamo le caratteristiche di questa diagnostica e le aree di applicazione.

Oggetti diagnostici

Attualmente, il metodo diagnostico biochimico è associato allo studio del sudore, dell'urina e di altri fluidi biologici. Con il suo aiuto, è possibile identificare l'attività degli enzimi e determinare il contenuto quantitativo dei prodotti metabolici in vari fluidi biologici.

Il metodo biochimico consente di determinare i disturbi metabolici causati da fattori ereditari.

Storia della scoperta

All'inizio del XX secolo, il medico inglese A. Garrod studiò l'alcaptonuria. Ha potuto constatare che con l'assenza di determinati enzimi è possibile identificare i disordini metabolici e determinare il metabolismo innato.

Varie malattie ereditarie sono causate da varie mutazioni nei geni, che portano a cambiamenti nella velocità di sintesi delle molecole proteiche e cambiamenti nella loro struttura. Come risultato di tali cambiamenti, si osserva una violazione del metabolismo dei lipidi, delle proteine ​​e dei carboidrati.

Il metodo biochimico consente di analizzare la composizione chimica di tessuti e materiali.

In caso di patologia, possono verificarsi cambiamenti nella concentrazione e possono comparire alcuni componenti aggiuntivi. Questo metodo consente di determinare gli enzimi e studiare l'equilibrio ormonale.

Classificazione

Il metodo biochimico è suddiviso in opzioni qualitative e quantitative. Per la determinazione qualitativa vengono utilizzate proprietà caratteristiche della sostanza utilizzata; possono manifestarsi durante reazioni chimiche: riscaldamento, aggiunta di determinati reagenti.

Il metodo biochimico quantitativo prevede il rilevamento iniziale di una sostanza, quindi il suo calcolo quantitativo.

I mediatori e gli ormoni contenuti in piccole quantità nel corpo umano vengono rilevati utilizzando oggetti di prova.

Il metodo di ricerca biochimica viene costantemente migliorato, il che rende possibile ottenere risultati di massima accuratezza sui processi metabolici che si verificano nelle cellule e negli organi. Attualmente, tali metodi diagnostici sono combinati con altri metodi di ricerca, ad esempio analisi istologiche, immunitarie e citologiche.

Per utilizzare tecniche complesse, vengono utilizzate attrezzature specializzate.

I metodi di analisi biochimica consentono di sviluppare e applicare un metodo rapido e semplificato che consente di determinare la valutazione di parametri biochimici specifici in pochi minuti.

Attualmente i laboratori di analisi dispongono di attrezzature moderne, strumenti e sistemi automatici che consentono di identificare l'indicatore richiesto con la massima precisione.

Modalità di svolgimento

Il metodo di ricerca biochimica consente di determinare in vari modi qualsiasi sostanza presente nei fluidi biologici. Ad esempio, è possibile rilevare un indicatore come la colesterolo esterasi utilizzando attrezzature moderne. Quando si sceglie una tecnica specifica, viene presa in considerazione la natura dei fluidi biologici da analizzare.

Il metodo di studio biochimico viene utilizzato per identificare una sostanza specifica in un'unica versione, nonché per studiare la dinamica dei cambiamenti. Questo indicatore viene analizzato in base a un determinato carico, periodo di tempo e durante l'assunzione di determinate sostanze chimiche.

Specifiche del metodo

Il metodo biochimico della genetica garantisce una rapida analisi del materiale biologico. È adatto per un uso ripetuto, permette di analizzare le strutture cromosomiche e identificarne il cariotipo. Grazie a questa tecnica, gli specialisti identificano le malattie monogeniche ed ereditarie associate a polimorfismi e mutazioni dei geni, nonché alle loro strutture.

I moderni metodi biochimici vengono utilizzati per trovare nuove forme di alleli mutanti nel DNA. Grazie a questa tecnica sono state identificate migliaia di malattie associate ai processi metabolici. Molti di questi sono problemi associati a difetti enzimatici e a cambiamenti nelle proteine ​​strutturali.

Per diagnosticare i disturbi metabolici vengono utilizzate due fasi. Innanzitutto vengono selezionati i possibili casi della malattia. Quindi viene chiarita la diagnosi iniziale, armata di tecniche e attrezzature complesse e precise.

Ad esempio, nel periodo prenatale, le malattie ereditarie vengono diagnosticate nei neonati utilizzando un metodo di analisi biochimica. Ciò consente di rilevare tempestivamente i cambiamenti patologici e iniziare immediatamente il trattamento.

Tipi di analisi biochimiche

Come è suddiviso il metodo biochimico? La determinazione di varie sostanze chimiche viene effettuata in diversi modi. L'essenza della tecnica è identificare determinati prodotti biochimici. Il motivo è che l'effetto dei diversi alleli cambia. Il principio di determinazione è quello di identificare gli acidi nucleici e le proteine ​​alterate mediante elettroforesi su gel insieme ad altre tecniche: autoradiografia, ibridazione blot.

L'analisi biochimica consente di identificare i portatori eterozigoti di varie malattie. A causa dei processi di mutazione che si verificano nel corpo umano, compaiono riarrangiamenti cromosomici che influiscono negativamente sulla salute umana.

Inoltre, i moderni metodi diagnostici biochimici consentono di determinare vari polimorfismi e anche di causare mutazioni in vari geni.

Tra i metodi comuni della biochimica moderna segnaliamo la centrifugazione, la dialisi e la cromatografia.

Metodi di ricerca ottica

La spettroscopia di assorbimento si basa sul principio della determinazione della luce assorbita che passa attraverso una soluzione di un analita a seguito dell'assorbimento.

Per misurare gli spettri vengono utilizzati speciali dispositivi spettrali. Posizionano un campione del farmaco analizzato tra una fotocellula e una fonte di luce. Ogni sostanza biologica ha un certo assorbimento della luce.

Per effettuare studi analitici viene utilizzata una lunghezza d'onda che corrisponde al massimo assorbimento dell'analita.

La fotoelettrocolorimetria è la determinazione della parte visibile dello spettro con soluzioni colorate.

La spettrofotometria, richiesta nell'analisi moderna, è la determinazione della trasmissione (assorbimento) di liquidi trasparenti nelle zone visibili, ultraviolette e infrarosse dello spettro.

Tra i principali strumenti utilizzati per le misurazioni segnaliamo gli spettrofotometri e i fotoelettrocolorimetri. Questi dispositivi tecnici consentono di effettuare misurazioni precise in una vasta gamma di lunghezze d'onda, dall'ultravioletto all'infrarosso.

L'elettroforesi nella medicina moderna

Questo fenomeno comporta il movimento di particelle cariche in un campo elettrico. Il loro comportamento può essere descritto da tre caratteristiche fondamentali: velocità delle particelle, mobilità elettroforetica e potenziale elettrocinetico.

Tra i numerosi metodi utilizzati per gli studi analitici, è l'elettroforesi che consente di separare miscele di sostanze in frazioni separate ed effettuare la loro determinazione quantitativa e qualitativa. Ad esempio, una tecnica simile può essere utilizzata per separare le proteine ​​del siero del sangue in albumina e quattro frazioni di globulina. Questo problema viene spesso risolto nella biochimica clinica, poiché la determinazione dei processi patologici che si verificano nel corpo del paziente dipende dal rapporto delle frazioni.

Attualmente viene eseguita l'elettroforesi libera (frontale) associata a un mezzo liquido, nonché una versione zonale in mezzi di supporto. Possono essere materiali porosi inerti sintetici o naturali: amido, acetato di cellulosa, carta, gel sintetico di poliacrilammide.

Il compito di un tale mezzo è stabilizzare il liquido, ridurre la diffusione e creare un ulteriore meccanismo di separazione.

Recentemente, la separazione in base al peso molecolare è stata utilizzata insieme alla mobilità elettroforetica.

Un tipo di analisi moderna

L'elettroforesi su disco è una versione ad alta risoluzione di questo metodo. La sua essenza sta nel fatto che le molecole si muovono prima attraverso un gel concentrante a grande porosità, dove la miscela viene separata attraverso il movimento tra diversi tipi di ioni. La risoluzione del metodo si ottiene concentrando il campione in una piccola zona iniziale prima di decomporlo, separando così sostanze che differiscono leggermente nelle proprietà.

I metodi cromatografici si basano sulla divisione dinamica di una miscela di sostanze biologiche. La loro essenza è che il flusso della fase mobile, che contiene l'analita, passa attraverso la fase stazionaria, che è accompagnata dall'interazione con i componenti del campione. Le fasi per questa analisi sono selezionate in modo che i coefficienti di distribuzione dei componenti della miscela differiscano.

A seconda dello stato di aggregazione della fase mobile, esiste una divisione dei metodi cromatografici in liquidi e gassosi. Tenendo conto della forma geometrica della fase stazionaria, si distinguono la cromatografia planare e quella su colonna.

In base al meccanismo di separazione dei preparati biologici, attualmente si distingue la cromatografia ad adsorbimento, in base alle diverse capacità di adsorbimento dei componenti del liquido separato all'interfaccia tra due fasi.

La cromatografia di distribuzione, o adsorbimento, si basa sulla diversa capacità di assorbire il volume della fase liquida dei componenti della miscela analizzata.

Conclusione

L'analisi biochimica è necessaria per la diagnosi precoce di malattie gravi. Ad esempio, la cromatografia di affinità può isolare un componente specifico da qualsiasi miscela biologica.

Una tecnica simile viene utilizzata per purificare anticorpi e antigeni, recettori, enzimi e ormoni. La centrifugazione gioca un ruolo speciale in biochimica. Lo studio e la separazione delle sostanze con questo metodo si basa su diverse velocità di sedimentazione (decantazione) in un campo centrifugo di particelle che hanno densità, dimensioni e forme diverse. Con la corretta selezione della velocità di centrifugazione, è possibile precipitare mitocondri, ribosomi e lisosomi.

I metodi dei radioisotopi si basano sulla capacità degli isotopi instabili di emettere radiazioni elettromagnetiche o particelle rilevate da speciali dispositivi elettronici.

Tra gli ovvi vantaggi di tutti i metodi moderni utilizzati in medicina, segnaliamo la capacità di analizzare le trasformazioni metaboliche e determinare l'età dei preparati biologici. Tali studi aiutano a trattare i pazienti in modo tempestivo.