Reazioni immunologiche. Le reazioni immunologiche del Dipartimento di Microbiologia e Virologia dell'Istituto di Bilancio dello Stato Federale nella reazione di adsorbimento delle agglutinine secondo Castellani vengono utilizzate per uno studio dettagliato della struttura antigenica dei batteri al fine di determinarne la ser

Il concetto di immunità significa l'immunità del corpo a qualsiasi agente geneticamente estraneo, compresi gli agenti patogeni e i loro veleni (dal latino immunitas - liberazione da qualcosa).

Quando strutture geneticamente estranee (antigeni) entrano nell'organismo, entrano in gioco una serie di meccanismi e fattori che riconoscono e neutralizzano queste sostanze estranee all'organismo.

Il sistema di organi e tessuti che realizza le reazioni protettive dell’organismo contro i disturbi della costanza del suo ambiente interno (omeostasi) è chiamato sistema immunitario.

La scienza dell'immunità: l'immunologia studia le reazioni del corpo alle sostanze estranee, compresi i microrganismi; reazioni del corpo ai tessuti estranei (compatibilità) e ai tumori maligni; determina i gruppi sanguigni immunologici, ecc. Le basi dell'immunologia furono gettate dalle osservazioni spontanee degli antichi sulla possibilità di proteggere artificialmente una persona da una malattia infettiva. Le osservazioni delle persone che erano nell'epicentro dell'epidemia hanno portato alla conclusione che non tutti si ammalano. Pertanto, coloro che sono guariti da questa malattia non soffrono della peste; Il morbillo viene solitamente contratto una volta durante l'infanzia; coloro che hanno avuto il vaiolo bovino non si ammalano di vaiolo, ecc.

Esistono modi noti con cui i popoli antichi si proteggevano dai morsi di serpente strofinando piante macinate con veleno di serpente nei tagli sulla pelle; proteggere le mandrie dalla peripneumonite del bestiame, praticando anche dei tagli sulla pelle con un pugnale, precedentemente immerso nei polmoni di un toro morto a causa di questa malattia.

La prima vaccinazione artificiale per prevenire l'infezione fu effettuata da E. Jenner (1876). Tuttavia, solo L. Pasteur è stato in grado di dimostrare scientificamente i principi della protezione artificiale contro le malattie infettive. Ha dimostrato che l'infezione da agenti patogeni indeboliti porta all'immunità del corpo ai ripetuti incontri con questi microrganismi.

Pasteur ha sviluppato farmaci che proteggono dall'antrace e dalla rabbia.

L'immunologia è stata ulteriormente sviluppata nei lavori di I. I. Mechnikov sull'importanza dell'immunità cellulare (fagocitosi) e di P. Ehrlich sul ruolo dei fattori umorali (fluidi corporei) per lo sviluppo dell'immunità.

Attualmente l’immunologia è una scienza in cui la protezione dalle malattie infettive è solo uno degli anelli. Spiega le ragioni della compatibilità e del rigetto dei tessuti durante il trapianto di organi, la morte del feto in una situazione di conflitto Rhesus, le complicazioni durante la trasfusione di sangue, risolve i problemi della medicina legale, ecc.

I principali tipi di immunità sono presentati nel diagramma.

Immunità ereditaria (di specie).

L'immunità ereditaria (di specie) è la forma di immunità più duratura e perfetta, causata da fattori ereditari di resistenza (sostenibilità).

È noto che gli esseri umani sono immuni alla peste canina e bovina e che gli animali non soffrono di colera e difterite. Tuttavia, l'immunità ereditaria non è assoluta: creando condizioni particolari e sfavorevoli per il macroorganismo, la sua immunità può essere modificata. Ad esempio, il surriscaldamento, il raffreddamento, la carenza vitaminica e l’azione degli ormoni portano allo sviluppo di una malattia solitamente insolita per l’uomo o gli animali. Così Pasteur, raffreddando i polli, li ha infettati con l'antrace attraverso un'infezione artificiale, di cui non si ammalano in condizioni normali.

Immunità acquisita

L'immunità acquisita in una persona si forma per tutta la vita, non è ereditata.

Immunità naturale. L'immunità attiva si forma dopo una malattia (si chiama post-infettiva). Nella maggior parte dei casi persiste a lungo: dopo il morbillo, la varicella, la peste, ecc. Tuttavia, dopo alcune malattie, la durata dell'immunità è breve e non supera un anno (influenza, dissenteria, ecc.). A volte l'immunità attiva naturale si sviluppa senza malattie visibili. Si forma a seguito di un'infezione latente (latente) o di un'infezione ripetuta con piccole dosi dell'agente patogeno che non causano una malattia evidente (immunizzazione frazionaria, domestica).

L'immunità passiva è l'immunità dei neonati (placentare), acquisita da loro attraverso la placenta durante lo sviluppo intrauterino. I neonati possono anche acquisire l'immunità dal latte materno. Questo tipo di immunità è di breve durata e di solito scompare entro 6-8 mesi. Tuttavia, l'importanza dell'immunità passiva naturale è grande: garantisce l'immunità dei bambini alle malattie infettive.

Immunità artificiale. Una persona acquisisce l'immunità attiva a seguito dell'immunizzazione (vaccinazioni). Questo tipo di immunità si sviluppa dopo l'introduzione nel corpo di batteri, dei loro veleni, virus, indeboliti o uccisi in vari modi (vaccinazioni contro la pertosse, la difterite, il vaiolo).

Allo stesso tempo, nel corpo avviene una ristrutturazione attiva, finalizzata alla formazione di sostanze che hanno un effetto dannoso sull'agente patogeno e sulle sue tossine (anticorpi). C'è anche un cambiamento nelle proprietà delle cellule che distruggono i microrganismi e i loro prodotti metabolici. Lo sviluppo dell'immunità attiva avviene gradualmente nell'arco di 3-4 settimane e persiste per un tempo relativamente lungo, da 1 anno a 3-5 anni.

L'immunità passiva viene creata introducendo anticorpi già pronti nel corpo. Questo tipo di immunità si verifica immediatamente dopo l'introduzione degli anticorpi (sieri e immunoglobuline), ma dura solo 15-20 giorni, dopodiché gli anticorpi vengono distrutti ed espulsi dal corpo.

Il concetto di “immunità locale” è stato introdotto da A. M. Bezredka. Credeva che le singole cellule e tessuti del corpo avessero una certa suscettibilità. Immunizzandoli creano una barriera alla penetrazione degli agenti infettivi. Attualmente è stata dimostrata l'unità dell'immunità locale e generale. Ma l'importanza dell'immunità dei singoli tessuti e organi nei confronti dei microrganismi è innegabile.

Oltre alla suddetta divisione dell'immunità per origine, esistono forme di immunità rivolte a diversi antigeni.

Immunità antimicrobica si sviluppa in malattie causate da vari microrganismi o con l'introduzione di vaccini corpuscolari (da microrganismi vivi indeboliti o uccisi).

Immunità antitossica prodotto in relazione ai veleni batterici - tossine.

Immunità antivirale formato dopo malattie virali. Questo tipo di immunità è per lo più duratura e persistente (morbillo, varicella, ecc.). L’immunità antivirale si sviluppa anche durante l’immunizzazione con vaccini virali.

Inoltre, l'immunità può essere suddivisa in base al periodo di rilascio del corpo dall'agente patogeno.

Immunità sterile. La maggior parte degli agenti patogeni scompaiono dal corpo quando una persona guarisce. Questo tipo di immunità è chiamata sterile (morbillo, vaiolo, ecc.).

Immunità non sterile. La sensibilità all’agente infettivo persiste solo durante la sua permanenza nel corpo dell’ospite. Tale immunità è chiamata non sterile o infettiva. Questo tipo di immunità si osserva nella tubercolosi, nella sifilide e in alcune altre infezioni.

Domande di controllo

1. Cos'è l'immunità?

2. Quali forme di immunità conosci?

L’immunità umana alle malattie infettive è dovuta all’azione combinata di fattori protettivi aspecifici e specifici.

Non specifiche sono le proprietà innate del corpo che contribuiscono alla distruzione di un'ampia varietà di microrganismi sulla superficie del corpo umano e nelle cavità del corpo.

Lo sviluppo di fattori protettivi specifici avviene dopo che l'organismo entra in contatto con agenti patogeni o tossine; l'azione di questi fattori è diretta solo contro questi agenti patogeni o le loro tossine.

Fattori di difesa dell'organismo aspecifici

Esistono fattori meccanici, chimici e biologici che proteggono il corpo dagli effetti dannosi di vari microrganismi.

Pelle. La pelle intatta costituisce una barriera alla penetrazione dei microrganismi. In questo caso sono importanti i fattori meccanici: il rigetto dell'epitelio e le secrezioni delle ghiandole sebacee e sudoripare, che aiutano a rimuovere i microrganismi dalla pelle.

Il ruolo dei fattori chimici protettivi è svolto anche dalle secrezioni delle ghiandole cutanee (sebacee e sudoripare). Contengono acidi grassi e lattici, che hanno un effetto battericida (uccidono i batteri).

I fattori protettivi biologici sono determinati dagli effetti distruttivi della normale microflora cutanea sui microrganismi patogeni.

Membrane mucose diversi organi sono una delle barriere alla penetrazione dei microrganismi. Nel tratto respiratorio la protezione meccanica è fornita dall'epitelio ciliato. Il movimento delle ciglia dell'epitelio delle vie respiratorie superiori sposta costantemente il film di muco insieme a vari microrganismi verso le aperture naturali: la cavità orale e i passaggi nasali. I peli nei passaggi nasali hanno lo stesso effetto sui batteri. Tosse e starnuti aiutano a rimuovere i microrganismi e ad impedirne l'aspirazione (inalazione).

Lacrime, saliva, latte materno e altri fluidi corporei contengono lisozima. Ha un effetto distruttivo (chimico) sui microrganismi. L'ambiente acido del contenuto gastrico influisce anche sui microrganismi.

La normale microflora delle mucose, in quanto fattore di difesa biologica, è antagonista dei microrganismi patogeni.

Domande di controllo

1. Cosa sono i fattori protettivi aspecifici?

2. Quali fattori impediscono la penetrazione di microrganismi patogeni attraverso la pelle e le mucose?

Infiammazione- la reazione di un macroorganismo alle particelle estranee che penetrano nel suo ambiente interno. Una delle cause dell'infiammazione è l'introduzione di agenti infettivi nel corpo. Lo sviluppo dell'infiammazione porta alla distruzione di microrganismi o al rilascio da essi.

L'infiammazione è caratterizzata da una ridotta circolazione del sangue e della linfa nella zona interessata. È accompagnato da febbre, gonfiore, arrossamento e dolore.

Fattori cellulari di protezione aspecifica

Fagocitosi

Uno dei principali meccanismi dell'infiammazione è la fagocitosi, il processo di assorbimento dei batteri.

Il fenomeno della fagocitosi fu descritto per la prima volta da I. I. Mechnikov. Ha iniziato a studiare la fagocitosi da un'ameba unicellulare, per la quale la fagocitosi è un metodo di assimilazione del cibo. Avendo tracciato questo processo in diverse fasi di sviluppo del mondo animale, I. I. Mechnikov lo completò con la scoperta di cellule umane specializzate, con l'aiuto delle quali i batteri vengono distrutti, le cellule morte vengono riassorbite, focolai di emorragie, ecc. fu creata la dottrina della fagocitosi, utilizzata ancora oggi e di grande importanza.

Varie cellule del corpo (leucociti del sangue, cellule endoteliali dei vasi sanguigni) hanno attività fagocitaria. Questa attività è più pronunciata nei leucociti polimorfonucleati mobili, nei monociti del sangue e nei macrofagi tissutali e, in misura minore, nelle cellule del midollo osseo. Tutte le cellule fagocitiche mononucleari (e i loro precursori del midollo osseo) sono unite nel sistema dei fagociti mononucleari (MPS).

Le cellule fagocitiche hanno lisosomi che contengono più di 25 diversi enzimi idrolitici e proteine ​​che hanno proprietà antibatteriche.

Fasi della fagocitosi. Fase 1: l'approccio del fagocita all'oggetto a causa dell'influenza chimica di quest'ultimo. Questo movimento è chiamato chemiotassi positiva (verso l'oggetto).

Fase 2: adesione dei microrganismi ai fagociti.

Fase 3: assorbimento dei microrganismi da parte della cellula, formazione di un fagosoma.

Fase 4: formazione di un fagolisosoma, che riceve enzimi e proteine ​​battericide, morte e digestione dell'agente patogeno.

Il processo che termina con la morte dei microbi fagocitati è chiamato fagocitosi completa.

Tuttavia, alcuni microrganismi, mentre sono all'interno dei fagociti, non muoiono e talvolta si moltiplicano addirittura in essi. Questi sono gonococchi, mycobacterium tuberculosis e brucella. Questo fenomeno è chiamato fagocitosi incompleta; in questo caso i fagociti muoiono.

Come altre funzioni fisiologiche, la fagocitosi dipende dallo stato del corpo: dal ruolo regolatore del sistema nervoso centrale, dall'alimentazione e dall'età.

L'attività fagocitaria dei leucociti cambia in molte malattie, spesso non infettive. Determinando una serie di indicatori di fagocitosi, è possibile stabilire il decorso della malattia: recupero o peggioramento delle condizioni del paziente, efficacia del trattamento, ecc.

Per valutare lo stato funzionale dei fagociti, l'attività di assorbimento viene spesso determinata utilizzando due test: 1) indicatore fagocitico - la percentuale di cellule fagocitiche (il numero di leucociti con microbi assorbiti su 100 osservati); 2) numero fagocitico - il numero medio di microbi o altri oggetti di fagocitosi assorbiti da un leucocita.

Le capacità battericide dei fagociti sono determinate dal numero di lisosomi, dall'attività degli enzimi intracellulari e da altri metodi.

L'attività della fagocitosi è associata alla presenza di anticorpi - opsonine - nel siero del sangue. Questi anticorpi migliorano la fagocitosi e preparano la superficie cellulare per l'assorbimento da parte di un fagocito.

L'attività della fagocitosi determina in gran parte l'immunità del corpo verso un particolare agente patogeno. In alcune malattie la fagocitosi è il principale fattore protettivo, in altre è un fattore ausiliario. Tuttavia, in tutti i casi, la mancanza di capacità fagocitica delle cellule peggiora drasticamente il decorso e la prognosi della malattia.

Reattività cellulare

Lo sviluppo del processo infettivo e la formazione dell'immunità dipendono completamente dalla sensibilità primaria delle cellule all'agente patogeno. L'immunità ereditaria delle specie è un esempio della mancanza di sensibilità delle cellule di una specie animale ai microrganismi patogeni per gli altri. Il meccanismo di questo fenomeno non è ben compreso. È noto che la reattività delle cellule cambia con l'età e sotto l'influenza di vari fattori (fisici, chimici, biologici).

Domande di controllo

1. Cos'è la fagocitosi?

2. Quali fasi della fagocitosi conosci?

3. Cos'è la fagocitosi completa e incompleta?

Fattori umorali di protezione aspecifica

Oltre ai fagociti, il sangue contiene sostanze solubili non specifiche che hanno un effetto dannoso sui microrganismi. Questi includono complemento, correttadina, β-lisina, x-lisina, eritrina, leuchine, plachine, lisozima, ecc.

Il complemento (dal latino complementum - addizione) è un sistema complesso di frazioni proteiche del sangue che ha la capacità di lisare microrganismi e altre cellule estranee, come i globuli rossi. Esistono diversi componenti del complemento: C 1, C 2, C 3, ecc. Il complemento viene distrutto ad una temperatura di 55 ° C per 30 minuti. Questa proprietà è chiamata termolabilità. Viene anche distrutto dall'agitazione, sotto l'influenza dei raggi UV, ecc. Oltre al siero del sangue, il complemento si trova in vari fluidi corporei e nell'essudato infiammatorio, ma è assente nella camera anteriore dell'occhio e nel liquido cerebrospinale.

La properdina (dal latino ownde - preparare) è un gruppo di componenti del siero del sangue normale che attiva il complemento in presenza di ioni magnesio. È simile agli enzimi e svolge un ruolo importante nella resistenza del corpo alle infezioni. Una diminuzione del livello di owndina nel siero del sangue indica un'attività insufficiente dei processi immunitari.

Le β-lisine sono sostanze termostabili (resistenti alla temperatura) nel siero del sangue umano che hanno un effetto antimicrobico, principalmente contro i batteri gram-positivi. Distrutto a 63° C e sotto l'influenza dei raggi UV.

La X-lisina è una sostanza termostabile isolata dal sangue di pazienti con febbre alta. Ha la capacità di lisare i batteri, principalmente quelli gram-negativi, senza la partecipazione del complemento. Resiste al riscaldamento fino a 70-100° C.

L'eritrina viene isolata dagli eritrociti animali. Ha un effetto batteriostatico sugli agenti patogeni della difterite e su alcuni altri microrganismi.

Le leuchine sono sostanze battericide isolate dai leucociti. Stabile al calore, si distrugge a 75-80° C. Presente nel sangue in piccolissime quantità.

Le plakin sono sostanze simili alle leuchine isolate dalle piastrine.

Il lisozima è un enzima che distrugge la membrana delle cellule microbiche. Si trova nelle lacrime, nella saliva e nei fluidi sanguigni. La rapida guarigione delle ferite della congiuntiva dell'occhio, delle mucose della cavità orale e del naso è in gran parte dovuta alla presenza del lisozima.

Anche i componenti costitutivi dell'urina, del liquido prostatico e degli estratti di vari tessuti hanno proprietà battericide. Il siero normale contiene piccole quantità di interferone.

Domande di controllo

1. Quali sono i fattori umorali di protezione aspecifica?

2. Quali fattori umorali di protezione aspecifica conosci?

Fattori specifici di difesa dell’organismo (immunità)

I componenti sopra elencati non esauriscono l'intero arsenale di fattori di protezione umorale. I principali tra questi sono gli anticorpi specifici - le immunoglobuline, che si formano quando agenti estranei - gli antigeni - vengono introdotti nel corpo.

Antigeni

Gli antigeni sono sostanze geneticamente estranee all'organismo (proteine, nucleoproteine, polisaccaridi, ecc.), alla cui introduzione l'organismo risponde sviluppando specifiche reazioni immunologiche. Una di queste reazioni è la formazione di anticorpi.

Gli antigeni hanno due proprietà principali: 1) immunogenicità, cioè la capacità di indurre la formazione di anticorpi e linfociti immunitari; 2) la capacità di entrare in un'interazione specifica con anticorpi e linfociti immunitari (sensibilizzati), che si manifesta sotto forma di reazioni immunologiche (neutralizzazione, agglutinazione, lisi, ecc.). Gli antigeni che possiedono entrambe le caratteristiche sono detti completi. Questi includono proteine ​​estranee, sieri, elementi cellulari, tossine, batteri, virus.

Le sostanze che non provocano reazioni immunologiche, in particolare la produzione di anticorpi, ma entrano in un'interazione specifica con anticorpi già pronti, sono chiamate apteni - antigeni difettosi. Gli apteni acquisiscono le proprietà di antigeni a tutti gli effetti dopo essersi combinati con sostanze di grandi dimensioni molecolari: proteine, polisaccaridi.

Le condizioni che determinano le proprietà antigeniche delle varie sostanze sono: estraneità, macromolecolarità, stato colloidale, solubilità. L'antigenicità si manifesta quando una sostanza entra nell'ambiente interno del corpo, dove incontra le cellule del sistema immunitario.

La specificità degli antigeni, la loro capacità di combinarsi solo con l'anticorpo corrispondente, è un fenomeno biologico unico. È alla base del meccanismo per mantenere la costanza dell'ambiente interno del corpo. Questa costanza è assicurata dal sistema immunitario, che riconosce e distrugge le sostanze geneticamente estranee (compresi i microrganismi e i loro veleni) presenti nel suo ambiente interno. Il sistema immunitario umano è sotto costante sorveglianza immunologica. È in grado di riconoscere l'estraneità quando le cellule differiscono per un solo gene (cancro).

La specificità è una caratteristica strutturale delle sostanze per cui gli antigeni differiscono l'uno dall'altro. È determinato dal determinante antigenico, cioè da una piccola parte della molecola dell'antigene, che si combina con l'anticorpo. Il numero di tali siti (raggruppamenti) è diverso per i diversi antigeni e determina il numero di molecole di anticorpi con cui l'antigene può legarsi (valenza).

La capacità degli antigeni di combinarsi solo con quegli anticorpi sorti in risposta all'attivazione del sistema immunitario da parte di un dato antigene (specificità) viene utilizzata in pratica: 1) diagnosi di malattie infettive (determinazione di antigeni specifici di un agente patogeno o anticorpi specifici in il siero del paziente); 2) prevenzione e trattamento di pazienti con malattie infettive (creazione di immunità a determinati microbi o tossine, neutralizzazione specifica dei veleni di agenti patogeni di una serie di malattie durante l'immunoterapia).

Il sistema immunitario distingue chiaramente tra antigeni “auto” e “estranei”, reagendo solo a questi ultimi. Tuttavia, sono possibili reazioni agli antigeni del corpo - autoantigeni e comparsa di anticorpi contro di essi - autoanticorpi. Gli autoantigeni diventano antigeni “barriera”: cellule, sostanze che durante la vita di un individuo non entrano in contatto con il sistema immunitario (il cristallino dell'occhio, lo sperma, la tiroide, ecc.), ma entrano in contatto con esso durante varie lesioni, di solito vengono assorbite nel sangue. E poiché durante lo sviluppo del corpo questi antigeni non sono stati riconosciuti come “sé”, non si è formata la tolleranza naturale (reattività immunologica specifica), cioè le cellule del sistema immunitario sono rimaste nel corpo capaci di una risposta immunitaria a questi propri antigeni.

Come risultato della comparsa di autoanticorpi, possono svilupparsi malattie autoimmuni come conseguenza di: 1) l'effetto citotossico diretto degli autoanticorpi sulle cellule degli organi corrispondenti (ad esempio, il gozzo di Hashimoto - danno alla ghiandola tiroidea); 2) azione indiretta dei complessi autoantigene-autoanticorpo, che si depositano nell'organo interessato e ne provocano il danno (ad esempio lupus eritematoso sistemico, artrite reumatoide).

Antigeni di microrganismi. Una cellula microbica contiene un gran numero di antigeni che hanno posizioni diverse nella cellula e significato diverso per lo sviluppo del processo infettivo. Diversi gruppi di microrganismi hanno diverse composizioni antigeniche. Nei batteri intestinali, gli antigeni O, K e H sono stati ben studiati.

L'antigene O è associato alla parete cellulare della cellula microbica. Di solito veniva chiamato “somatico”, poiché si credeva che questo antigene fosse contenuto nel corpo (soma) della cellula. L'antigene O dei batteri gram-negativi è un complesso lipopolisaccaride-proteico (endotossina). È stabile al calore e non collassa se trattato con alcool e formaldeide. È costituito da un nucleo principale e da catene laterali di polisaccaridi. La specificità degli antigeni O dipende dalla struttura e dalla composizione di queste catene.

Gli antigeni K (capsulari) sono associati alla capsula e alla parete cellulare della cellula microbica. Sono anche chiamati conchiglie. Gli antigeni K si trovano più superficialmente degli antigeni O. Sono principalmente polisaccaridi acidi. Esistono diversi tipi di antigeni K: A, B, L, ecc. Questi antigeni differiscono l'uno dall'altro per la loro resistenza agli influssi della temperatura. L'antigene A è il più stabile, L il meno. Gli antigeni di superficie includono anche l'antigene Vi, che si trova negli agenti patogeni della febbre tifoide e in alcuni altri batteri intestinali. Viene distrutto a 60° C. La presenza dell'antigene Vi è stata associata alla virulenza dei microrganismi.

Gli antigeni H (flagellari) sono localizzati nei flagelli dei batteri. Sono una proteina speciale: la flagellina. Distrutto quando riscaldato. Se trattati con formalina mantengono le loro proprietà (vedi Fig. 70).

L'antigene protettivo (protettivo) (dal latino protectedio - protezione, protezione) è formato da agenti patogeni nel corpo del paziente. Gli agenti causali dell'antrace, della peste e della brucellosi sono in grado di formare un antigene protettivo. Si trova negli essudati dei tessuti colpiti.

Il rilevamento degli antigeni nel materiale patologico è uno dei metodi per la diagnosi di laboratorio delle malattie infettive. Varie reazioni immunitarie vengono utilizzate per rilevare l'antigene (vedi sotto).

Durante lo sviluppo, la crescita e la riproduzione dei microrganismi, i loro antigeni possono cambiare. Si verifica una perdita di alcuni componenti antigenici localizzati più superficialmente. Questo fenomeno è chiamato dissociazione. Un esempio di ciò è la dissociazione “S” - “R”.

Domande di controllo

1. Cosa sono gli antigeni?

2. Quali sono le principali proprietà degli antigeni?

3. Quali antigeni cellulari microbici conosci?

Anticorpi

Gli anticorpi sono proteine ​​​​specifiche del sangue - immunoglobuline, formate in risposta all'introduzione di un antigene e capaci di reagire specificamente con esso.

Esistono due tipi di proteine ​​nel siero umano: albumine e globuline. Gli anticorpi sono associati principalmente alle globuline modificate dall'antigene e chiamate immunoglobuline (Ig). Le globuline sono eterogenee. In base alla velocità di movimento nel gel quando viene attraversato da una corrente elettrica, si dividono in tre frazioni: α, β, γ. Gli anticorpi appartengono principalmente alle gamma-globuline. Questa frazione di globuline ha la massima velocità di movimento in un campo elettrico.

Le immunoglobuline sono caratterizzate da peso molecolare, velocità di sedimentazione durante l'ultracentrifugazione (centrifugazione ad altissima velocità), ecc. Le differenze in queste proprietà hanno permesso di dividere le immunoglobuline in 5 classi: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Tutti svolgono un ruolo nello sviluppo dell’immunità contro le malattie infettive.

Le immunoglobuline G (IgG) costituiscono circa il 75% di tutte le immunoglobuline umane. Sono più attivi nello sviluppo dell'immunità. Le uniche immunoglobuline penetrano nella placenta, fornendo immunità passiva al feto. Hanno un basso peso molecolare e una velocità di sedimentazione durante l'ultracentrifugazione.

L'immunoglobulina M (IgM) si forma nel feto ed è la prima a comparire dopo l'infezione o l'immunizzazione. Questa classe comprende anticorpi umani "normali", che si formano durante la sua vita, senza manifestazioni visibili di infezione o durante ripetute infezioni domestiche. Hanno un peso molecolare e una velocità di sedimentazione elevati durante l'ultracentrifugazione.

Le immunoglobuline A (IgA) hanno la capacità di penetrare nelle secrezioni della mucosa (colostro, saliva, contenuto bronchiale, ecc.). Svolgono un ruolo nella protezione delle mucose del tratto respiratorio e digestivo dai microrganismi. In termini di peso molecolare e velocità di sedimentazione durante l'ultracentrifugazione, sono vicini alle IgG.

Responsabili delle reazioni allergiche sono l'immunoglobulina E (IgE) o le reagine (vedi capitolo 13). Svolgono un ruolo nello sviluppo dell'immunità locale.

Immunoglobulina D (IgD). Trovato in piccole quantità nel siero del sangue. Non abbastanza studiato.

Struttura delle immunoglobuline. Le molecole di immunoglobuline di tutte le classi sono costruite allo stesso modo. La struttura più semplice delle molecole IgG è: due coppie di catene polipeptidiche collegate da un legame disolfuro (Fig. 31). Ciascuna coppia è costituita da una catena leggera e da una pesante, di peso molecolare diverso. Ogni catena ha sezioni costanti geneticamente predeterminate e sezioni variabili che si formano sotto l'influenza dell'antigene. Queste regioni specifiche dell'anticorpo sono chiamate centri attivi. Interagiscono con l'antigene che ha causato la formazione di anticorpi. Il numero di centri attivi in ​​una molecola di anticorpo determina la valenza, ovvero il numero di molecole di antigene con cui l'anticorpo può entrare in contatto. Le IgG e le IgA sono bivalenti, le IgM sono pentavalenti.

Immunogenesi- La formazione di anticorpi dipende dalla dose, dalla frequenza e dal metodo di somministrazione dell'antigene. Esistono due fasi della risposta immunitaria primaria all'antigene: induttiva - dal momento della somministrazione dell'antigene fino alla comparsa delle cellule che formano anticorpi (fino a 20 ore) e produttiva, che inizia entro la fine del primo giorno dopo la somministrazione dell'antigene ed è caratterizzato dalla comparsa di anticorpi nel siero del sangue. La quantità di anticorpi aumenta gradualmente (entro il 4° giorno), raggiungendo il massimo il 7-10° giorno e diminuisce entro la fine del primo mese.

Una risposta immunitaria secondaria si sviluppa quando l'antigene viene reintrodotto. Allo stesso tempo, la fase induttiva è molto più breve: gli anticorpi vengono prodotti più velocemente e in modo più intenso.

Domande di controllo

1. Cosa sono gli anticorpi?

2. Quali classi di immunoglobuline conosci?

Meccanismi cellulari della risposta immunitaria

Le cellule linfoidi del corpo svolgono la funzione principale nello sviluppo dell'immunità: l'immunità, non solo verso i microrganismi, ma anche verso tutte le cellule geneticamente estranee, ad esempio durante il trapianto di tessuti. Le cellule linfoidi hanno la capacità di distinguere il “sé” da “estraneo” ed eliminare “estraneo” (eliminare).

L'antenato di tutte le cellule del sistema immunitario è la cellula staminale emopoietica. Successivamente si sviluppano due tipi di linfociti: T e B (timo-dipendenti e borsa-dipendenti). Le cellule hanno ricevuto questi nomi in relazione alla loro origine. Le cellule T si sviluppano nel timo (timo o ghiandola del timo) e, sotto l'influenza di sostanze secrete dal timo, nel tessuto linfoide periferico.

Il nome linfociti B (dipendenti dalla borsa) deriva dalla parola “bursa” - borsa. Gli uccelli sviluppano cellule simili ai linfociti B umani nella borsa di Fabricius. Sebbene negli esseri umani non sia stato trovato alcun organo simile alla borsa di Fabricius, il nome è associato a questa borsa.

Quando i linfociti B si sviluppano da una cellula staminale, attraversano diverse fasi e si trasformano in linfociti che possono formare plasmacellule. Le plasmacellule, a loro volta, formano anticorpi e sulla loro superficie sono presenti immunoglobuline di tre classi: IgG, IgM e IgA (Fig. 32).

La risposta immunitaria sotto forma di produzione di anticorpi specifici avviene come segue: un antigene estraneo, penetrato nel corpo, viene principalmente fagocitato dai macrofagi. I macrofagi, elaborando e concentrando l'antigene sulla loro superficie, trasmettono informazioni su di esso alle cellule T, che iniziano a dividersi, "maturano" e secernono un fattore umorale, che include i linfociti B nella produzione di anticorpi. Anche queste ultime “maturano” e si sviluppano in plasmacellule, che sintetizzano anticorpi di una determinata specificità.

Pertanto, attraverso sforzi congiunti, i macrofagi, i linfociti T e B svolgono le funzioni immunitarie del corpo: protezione da tutto ciò che è geneticamente estraneo, compresi gli agenti patogeni delle malattie infettive. La protezione con l'aiuto degli anticorpi viene effettuata in modo tale che le immunoglobuline sintetizzate per un dato antigene, combinandosi con esso (antigene), lo preparino, lo rendano sensibile alla distruzione e alla neutralizzazione da parte di vari meccanismi naturali: fagociti, complemento, ecc.

Domande di controllo

1. Qual è il ruolo dei macrofagi nella risposta immunitaria?

2. Qual è il ruolo dei linfociti T nella risposta immunitaria?

3. Qual è il ruolo dei linfociti B nella risposta immunitaria?

Teorie dell'immunità. L’importanza degli anticorpi nello sviluppo dell’immunità è innegabile. Qual è il meccanismo della loro formazione? Questa questione è stata oggetto di dibattito e discussione per molto tempo.

Sono state create diverse teorie sulla formazione degli anticorpi, che possono essere divise in due gruppi: selettiva (selezione - selezione) e istruttiva (istruire - istruire, guidare).

Le teorie selettive presuppongono l'esistenza nel corpo di anticorpi già pronti contro ciascun antigene o di cellule in grado di sintetizzare questi anticorpi.

Pertanto, Ehrlich (1898) ipotizzò che la cellula avesse “recettori” (anticorpi) già pronti che si collegano all'antigene. Dopo la combinazione con l'antigene, si formano anticorpi in quantità ancora maggiori.

La stessa opinione fu condivisa dagli ideatori di altre teorie selettive: N. Erne (1955) e F. Burnet (1957). Sostenevano che già nel corpo fetale, e poi nel corpo adulto, ci sono cellule capaci di interagire con qualsiasi antigene, ma sotto l'influenza di determinati antigeni, alcune cellule producono gli anticorpi “necessari”.

Le teorie didattiche [Gaurowitz F., Pauling L., Landsteiner K., 1937-1940] considerano l'antigene come una “matrice”, un timbro su cui si formano specifici gruppi di molecole anticorpali.

Tuttavia, queste teorie non spiegavano tutti i fenomeni dell'immunità, e attualmente la più accettata è la teoria della selezione clonale di F. Burnet (1964). Secondo questa teoria, nel periodo embrionale, il feto possiede molti linfociti, cellule precursori, che vengono distrutte quando incontrano i propri antigeni. Pertanto, nel corpo adulto non ci sono più cellule in grado di produrre anticorpi contro i propri antigeni. Tuttavia, quando un organismo adulto incontra un antigene estraneo, avviene la selezione (selezione) di un clone di cellule immunologicamente attive che producono anticorpi specifici diretti contro questo antigene “estraneo”. Quando incontrano nuovamente questo antigene, ci sono più cellule del clone “selezionato” e formano rapidamente più anticorpi. Questa teoria spiega in modo più completo i fenomeni fondamentali dell'immunità.

Meccanismo di interazione tra antigene e anticorpi ha varie spiegazioni. Pertanto, Ehrlich paragonò la loro combinazione alla reazione tra un acido forte e una base forte con la formazione di una nuova sostanza come un sale.

Bordet credeva che l'antigene e gli anticorpi si assorbissero reciprocamente come la vernice e la carta da filtro o lo iodio e l'amido. Tuttavia, queste teorie non spiegavano la cosa principale: la specificità delle reazioni immunitarie.

Il meccanismo della connessione tra antigene e anticorpo è spiegato nel modo più completo dalle ipotesi di Marrek (teoria del reticolo) e Pauling (teoria della fattoria) (Fig. 33). Marrek considera la combinazione di antigene e anticorpi sotto forma di un reticolo, in cui l'antigene si alterna con l'anticorpo, formando conglomerati reticolari. Secondo l'ipotesi di Pauling (vedi Fig. 33), gli anticorpi hanno due valenze (due determinanti specifici) e un antigene ha diverse valenze: è polivalente. Quando antigene e anticorpi si combinano, si formano agglomerati che assomigliano a “fattorie” di edifici.

Con un rapporto ottimale tra antigene e anticorpi si formano complessi grandi e durevoli, visibili ad occhio nudo. Con un eccesso di antigene, ogni centro attivo di anticorpi si riempie di una molecola di antigene, non ci sono abbastanza anticorpi per combinarsi con altre molecole di antigene e si formano piccoli complessi invisibili all'occhio. Con un eccesso di anticorpi, non c'è abbastanza antigene per formare un reticolo, i determinanti anticorpali sono assenti e non vi è alcuna manifestazione visibile della reazione.

Sulla base delle teorie di cui sopra, la specificità della reazione antigene-anticorpo è oggi rappresentata come l'interazione del gruppo determinante dell'antigene e dei centri attivi dell'anticorpo. Poiché gli anticorpi si formano sotto l'influenza di un antigene, la loro struttura corrisponde ai gruppi determinanti dell'antigene. Il gruppo determinante dell'antigene e i frammenti dei centri attivi dell'anticorpo hanno cariche elettriche opposte e, se combinati, formano un complesso, la cui forza dipende dal rapporto dei componenti e dall'ambiente in cui interagiscono.

Lo studio dell'immunità - l'immunologia - ha ottenuto grandi successi negli ultimi decenni. La scoperta dei modelli del processo immunitario ha permesso di risolvere vari problemi in molti settori della medicina. Sono stati sviluppati e vengono migliorati metodi per prevenire molte malattie infettive; trattamento di malattie infettive e di una serie di altre malattie (autoimmuni, immunodeficienza); prevenire la morte fetale in situazioni di conflitto Rhesus; trapianto di tessuti e organi; combattere le neoplasie maligne; immunodiagnostica: l'uso delle reazioni immunitarie per scopi diagnostici.

Reazioni immunitarie- si tratta di reazioni tra un antigene e un anticorpo o tra un antigene e linfociti sensibilizzati* che avvengono in un organismo vivente e possono essere riprodotte in laboratorio.

* (Sensibilizzato - ipersensibile.)

Le reazioni immunitarie sono entrate nella pratica diagnostica delle malattie infettive alla fine del XIX e all'inizio del XX secolo. A causa della loro elevata sensibilità (catturano antigeni in diluizioni molto grandi) e, soprattutto, rigorosa specificità (consentono di distinguere antigeni simili nella composizione), hanno trovato ampia applicazione nella risoluzione di problemi teorici e pratici di medicina e biologia . Queste reazioni sono utilizzate da immunologi, microbiologi, specialisti in malattie infettive, biochimici, genetisti, biologi molecolari, oncologi sperimentali e medici di altre specialità.

Le reazioni di un antigene con un anticorpo sono chiamate sierologiche (dal latino siero - siero) o umorali (dal latino humor - liquido), perché gli anticorpi in esse coinvolti (immunoglobuline) si trovano sempre nel siero del sangue.

Le reazioni antigeniche con linfociti sensibilizzati sono chiamate reazioni cellulari.

Domande di controllo

1. Come si formano gli anticorpi?

2. Quali teorie sulla formazione di anticorpi conosci?

3. Qual è il meccanismo di interazione tra antigene e anticorpo?

Reazioni sierologiche

Reazioni sierologiche - le reazioni di interazione tra un antigene e un anticorpo si verificano in due fasi: 1a fase - specifica - la formazione di un complesso di un antigene e del suo anticorpo corrispondente (vedi Fig. 33). In questa fase non vi è alcun cambiamento visibile, ma il complesso risultante diventa sensibile ai fattori aspecifici presenti nell'ambiente (elettroliti, complemento, fagocita); 2a fase - non specifica. In questa fase il complesso specifico antigene-anticorpo interagisce con fattori ambientali aspecifici in cui avviene la reazione. Il risultato della loro interazione può essere visibile ad occhio nudo (incollaggio, dissoluzione, ecc.). A volte questi cambiamenti visibili sono assenti.

La natura della fase visibile delle reazioni sierologiche dipende dallo stato dell'antigene e dalle condizioni ambientali in cui avviene la sua interazione con l'anticorpo. Esistono reazioni di agglutinazione, precipitazione, lisi immunitaria, fissazione del complemento, ecc. (Tabella 14).

Applicazione dei test sierologici. Una delle principali applicazioni dei test sierologici è la diagnosi di laboratorio delle infezioni. Vengono utilizzati: 1) per rilevare gli anticorpi nel siero del paziente, cioè per la sierodiagnosi; 2) per determinare il tipo o il tipo di antigene, ad esempio, isolato da un microrganismo malato, ad es. per la sua identificazione.

In questo caso la componente sconosciuta viene determinata a partire da quella nota. Ad esempio, per rilevare gli anticorpi nel siero di un paziente, viene prelevata una coltura di laboratorio nota di un microrganismo (antigene). Se il siero reagisce con esso, contiene gli anticorpi corrispondenti e si può pensare che questo microbo sia l'agente eziologico della malattia nel paziente esaminato.

Se è necessario determinare quale microrganismo è isolato, viene testato in una reazione con un siero diagnostico (immune) noto. Un risultato di reazione positivo indica che questo microrganismo è identico a quello con cui l'animale è stato immunizzato per ottenere il siero (Tabella 15).

Le reazioni sierologiche vengono utilizzate anche per determinare l'attività (titolo) dei sieri e nella ricerca scientifica.

Effettuazione di reazioni sierologiche richiede una preparazione speciale.

I contenitori per le reazioni sierologiche devono essere puliti e asciutti. Vengono utilizzate provette (batteriologiche, di agglutinazione, di precipitazione e da centrifuga), pipette graduate di diverse dimensioni e pipette Pasteur*, beute, cilindri, vetrini e vetrini coprioggetto, piastre Petri, piastre di plastica con pozzetti.

* (Ciascun ingrediente di reazione viene versato in una pipetta separata. Le pipette devono essere conservate fino alla fine dell'esperimento. Per fare ciò, è conveniente metterli in provette sterili con segni che indicano quale pipetta è quale.)

Strumenti e attrezzature: ansa, supporti, lente d'ingrandimento, agglutinoscopio, termostato, frigorifero, centrifuga, bilancia chimica con pesi.

Materiali: anticorpi (sieri immunitari e di prova), antigeni (colture di microrganismi, diagnostici, estratti, lisati, apteni, eritrociti, tossine), complemento, soluzione isotonica di cloruro di sodio.

Attenzione! Nelle reazioni sierologiche viene utilizzato solo cloruro di sodio chimicamente puro.

Sieri. Siero del paziente. Il siero viene solitamente ottenuto nella seconda settimana di malattia, quando ci si può aspettare la presenza di anticorpi; a volte vengono utilizzati sieri di convalescenti (guarigione) e di guariti.

Molto spesso, per ottenere il siero, il sangue viene prelevato da una vena in una quantità di 3-5 ml in una provetta sterile e inviato al laboratorio, accompagnato da un'etichetta che indica il cognome e le iniziali del paziente, la diagnosi e la data previste.

Il prelievo del sangue deve essere effettuato a stomaco vuoto o non prima di 6 ore dopo il pasto. Il siero del sangue dopo aver mangiato può contenere goccioline di grasso, che lo rendono torbido e inadatto alla ricerca (questo siero è chiamato chiloso).

Attenzione! Quando si preleva il sangue è necessario seguire le regole dell'asepsi.

Per ottenere il siero, il sangue viene lasciato per 1 ora a temperatura ambiente o posto in un termostato a 37°C per 30 minuti per formare un coagulo.

Attenzione! Il siero non deve essere conservato nel termostato per più di 30 minuti: potrebbe verificarsi emolisi, che interferirà con la ricerca.

Il coagulo risultante viene separato dalle pareti della provetta con una pipetta o un'ansa Pasteur (“cerchiata”). La provetta viene posta in frigorifero per un certo tempo (di solito 1 ora, ma non più di 48 ore) per separare meglio il siero dal coagulo che si è ritirato dal freddo. Il siero viene quindi aspirato con una pipetta Pasteur sterile dotata di palloncino o tubo di gomma.

Il siero deve essere aspirato con molta attenzione per non catturare gli elementi formati. Il siero deve essere completamente trasparente senza alcuna mescolanza di cellule. I sieri torbidi vengono nuovamente aspirati dopo che le cellule si sono sedimentate. Il siero di latte può essere liberato dagli elementi formati mediante centrifugazione.

Attenzione! Il siero può rimanere sul coagulo per non più di 48 ore a + 4° C.

Per ottenere il siero, il sangue può essere prelevato da una puntura della carne di un dito o del lobo dell'orecchio con una pipetta Pasteur. Nei neonati, il sangue viene prelevato da un'incisione a forma di Y nel tallone.

Quando si utilizza una pipetta Pasteur, il sangue viene aspirato nella pipetta da una puntura. L'estremità affilata della pipetta è sigillata. La pipetta viene inserita nella provetta con l'estremità appuntita rivolta verso il basso. Per evitare che si rompa, si mette un pezzo di cotone sul fondo della provetta. La provetta con l'apposita etichetta viene inviata al laboratorio. Il siero accumulato nell'estremità larga della pipetta viene aspirato.

I sieri immunitari sono ottenuti dal sangue di persone o animali (solitamente conigli e cavalli), immunizzati secondo un determinato schema con l'antigene corrispondente (vaccino). Nel siero risultante viene determinata la sua attività (titolo), cioè la diluizione più alta con cui reagisce con l'antigene corrispondente in determinate condizioni sperimentali.

I sieri vengono solitamente preparati durante la produzione. Vengono versati in ampolle, sulle quali sono indicati il ​​nome e il titolo. Nella maggior parte dei casi, i sieri vengono essiccati. Prima dell'uso, il siero di latte secco viene sciolto in acqua distillata fino al volume originale (indicato anche in etichetta). Conservare tutte le preparazioni diagnostiche secche (liofilizzate) a 4-10° C.

Per gli studi sierologici vengono utilizzati sieri immunitari nativi (non adsorbiti) e adsorbiti. Lo svantaggio dei sieri nativi è la presenza in essi di anticorpi di gruppo, ad es. anticorpi contro microrganismi che hanno antigeni comuni. Tipicamente, tali antigeni si trovano in microbi appartenenti allo stesso gruppo, genere o famiglia. I sieri adsorbiti sono caratterizzati da una rigorosa specificità: reagiscono solo con un antigene omologo. Gli anticorpi verso altri antigeni (eterogenei) vengono rimossi mediante adsorbimento. Il titolo anticorpale dei sieri adsorbiti è basso (1:40, 1:320), quindi non vengono diluiti *.

* (Attualmente, utilizzando la biotecnologia, si sono ottenute cellule speciali (ibridomi) che producono anticorpi monoclonali in vitro, cioè anticorpi che reagiscono in modo strettamente specifico (con un antigene).)

Reazione di agglutinazione

La reazione di agglutinazione (RA) è l'incollaggio e la precipitazione di microbi o altre cellule sotto l'influenza di anticorpi in presenza di un elettrolita (soluzione isotonica di cloruro di sodio). Il precipitato risultante è chiamato agglutinato. Per la reazione di cui hai bisogno:

1. Anticorpi (agglutinine): si trovano nel siero del paziente o nel siero immunitario.

2. Antigene: una sospensione di microrganismi vivi o uccisi, globuli rossi o altre cellule.

3. Soluzione isotonica.

La reazione di agglutinazione per la sierodiagnosi è ampiamente utilizzata per la febbre tifoide, la febbre paratifoide (reazione di Vidal), la brucellosi (reazione di Wright), ecc. L'anticorpo in questo caso è il siero del paziente e l'antigene è un microbo noto.

Quando si identificano microbi o altre cellule, la loro sospensione viene utilizzata come antigene e un siero immunitario noto viene utilizzato come anticorpo. Questa reazione è ampiamente utilizzata nella diagnosi di infezioni intestinali, pertosse, ecc.

Preparazione degli ingredienti: 1) ottenere il siero di latte, vedi pag. 200; 2) preparazione dell'antigene. La sospensione di microbi vivi deve essere omogenea e corrispondere (in 1 ml) a circa 30 unità. torbidità secondo lo standard ottico GISC. Per la sua preparazione viene solitamente utilizzata una coltura di 24 ore coltivata su slant di agar. La coltura viene lavata via con 3-4 ml di soluzione isotonica, trasferita in una provetta sterile, la sua densità viene determinata e, se necessario, diluita.

L'uso di una sospensione di microbi uccisi - diagnosticum - facilita il lavoro e lo rende sicuro. Di solito utilizzano la diagnostica preparata in produzione.

Impostazione di una reazione. Esistono due metodi per eseguire questa reazione: la reazione di agglutinazione del vetro (a volte chiamata reazione indicativa) e la reazione di agglutinazione estesa (in provette).

Reazione di agglutinazione su vetro. Applicare 2 gocce di siero specifico (adsorbito) e una goccia di soluzione isotonica su un vetrino privo di grassi. I sieri non adsorbiti sono prediluiti in un rapporto di 1:5 - 1:25. Le gocce vengono applicate sul vetro in modo che ci sia una distanza tra loro. Usa una matita di cera per segnare sul vetro dove si trova ogni goccia. La coltura viene macinata accuratamente su vetro utilizzando un'ansa o una pipetta, quindi aggiunta ad una goccia di soluzione isotonica e ad una goccia di siero, mescolando ciascuna fino alla formazione di una sospensione omogenea. Una goccia di siero senza coltura costituisce un controllo del siero.

Attenzione! Non è possibile trasferire la coltura dal siero ad una goccia di soluzione isotonica, che è un controllo dell'antigene.

La reazione avviene a temperatura ambiente per 1-3 minuti. Il controllo del siero deve rimanere limpido e il controllo dell'antigene deve mostrare una torbidità uniforme. Se in una goccia in cui la coltura è mescolata con siero, compaiono scaglie di agglutinato sullo sfondo di un liquido limpido, il risultato della reazione è considerato positivo. Se la reazione è negativa la goccia presenterà una torbidità uniforme, come nel controllo dell'antigene.

La reazione è più chiaramente visibile se osservata su uno sfondo scuro in luce trasmessa. Quando lo studi, puoi usare una lente d'ingrandimento.

Reazione di agglutinazione dettagliata. Vengono preparate diluizioni seriali, molto spesso doppie, del siero. Il siero del paziente viene solitamente diluito da 1:50 a 1:1600, il siero immunitario viene diluito al titolo o alla metà del titolo. Il titolo di un siero agglutinante è la sua diluizione massima alla quale agglutina le cellule omologhe.

Diluizione del siero: 1) posizionare il numero richiesto di provette dello stesso diametro, altezza e configurazione di fondo in un rack;

2) su ciascuna provetta è indicato il grado di diluizione del siero, inoltre, sulla 1a provetta è scritto il numero dell'esperimento o il nome dell'antigene. Sulle provette di controllo scrivono "KS" - controllo del siero e "KA" - controllo dell'antigene;

3) in tutte le provette si versa 1 ml di soluzione isotonica;

4) la diluizione iniziale (di lavoro) del siero viene preparata in una provetta separata. Ad esempio, per preparare una diluizione di lavoro di 1:50, in una provetta vengono versati 4,9 ml di soluzione isotonica e 0,1 ml di siero. Il grado di diluizione deve essere indicato sulla provetta. La diluizione iniziale del siero viene aggiunta alle prime due provette e alla provetta del siero di controllo;

5) preparare diluizioni seriali doppie del siero.

Uno schema approssimativo per la sua diluizione è riportato nella tabella. 16.

Nota. Le frecce indicano il trasferimento del liquido da provetta a provetta; dalla 5a provetta e dalla provetta di controllo del siero versare 1,0 ml nella soluzione disinfettante.

Attenzione! Tutte le provette devono contenere lo stesso volume di liquido.

Dopo aver preparato le diluizioni del siero, 1-2 gocce di antigene (diagnosticum o sospensione di batteri appena preparata) vengono aggiunte a tutte le provette, ad eccezione del siero di controllo. Nelle provette dovrebbe apparire una leggera torbidità uniforme. Il controllo del siero rimane chiaro.

Le provette vengono agitate accuratamente e poste in un termostato (37°C). Una contabilità preliminare dei risultati della reazione viene effettuata dopo 2 ore, ed una contabilità finale dopo 18-20 ore (mantenimento a temperatura ambiente).

La contabilità dei risultati, come sempre, inizia con i controlli. Il controllo del siero deve rimanere limpido, il controllo dell'antigene uniformemente torbido. Esaminare i tubi in luce trasmessa (molto comodo su uno sfondo scuro) ad occhio nudo, utilizzando una lente d'ingrandimento o un agglutinoscopio.

Agglutinoscopio- un dispositivo costituito da un tubo metallico cavo montato su un supporto. Sopra c'è un oculare con una vite di regolazione. Sotto il tubo è fissato uno specchio rotante. La provetta con il liquido da studiare viene inserita lateralmente nel foro del tubo a una distanza tale che il liquido in esso contenuto sia sotto l'oculare. Impostando l'illuminazione utilizzando uno specchio e mettendo a fuoco l'oculare, si determina la presenza e la natura dell'agglutinato.

Se il risultato della reazione è positivo, nelle provette sono visibili granuli o scaglie di agglutinato. L'agglutinato si deposita gradualmente sul fondo sotto forma di un “ombrello” e il liquido sopra il sedimento diventa limpido (confrontare con il controllo antigene uniformemente torbido).

Per studiare la dimensione e la natura del precipitato, il contenuto delle provette viene leggermente agitato. Ci sono agglutinazioni a grana fine e flocculanti. La grana fine (agglutinazione O) si ottiene lavorando con O-sera *. A scaglie (H) - durante l'interazione di microrganismi mobili con sieri H flagellari.

* (I sieri O contengono anticorpi contro l'antigene O (somatico), i sieri H - contro l'antigene flagellare.)

L'agglutinazione flocculante avviene più velocemente; il precipitato risultante è molto sciolto e si rompe facilmente.

Tutte le cellule si sono depositate, il liquido nella provetta è completamente trasparente. Il risultato della reazione è nettamente positivo.

C'è meno sedimento, il liquido non si schiarisce completamente. Il risultato della reazione è positivo.

C'è ancora meno sedimento, il liquido è torbido. Il risultato della reazione è leggermente positivo.

Leggero sedimento, liquido torbido. Risultato della reazione discutibile.

Non c'è sedimento, il liquido è uniformemente torbido, come nel controllo antigene. Risultato negativo della reazione.

Possibili errori durante l'esecuzione di una reazione di agglutinazione. 1. Agglutinazione spontanea (spontanea). Alcune cellule, in particolare i microbi della forma R, non producono una sospensione uniforme (omogenea) e precipitano rapidamente. Per evitare ciò, è necessario utilizzare una coltura nella forma S, che non dà agglutinazione spontanea.

2. Il siero di persone sane contiene anticorpi contro determinati microrganismi (i cosiddetti “anticorpi normali”). Il loro titolo è basso. Pertanto, un risultato positivo di una reazione ad una diluizione pari o superiore a 1:100 ne indica la specificità.

3. Reazione di gruppo con microbi simili nella struttura antigenica. Ad esempio, il siero di un paziente con febbre tifoide può anche agglutinare i batteri paratifo A e B. A differenza della reazione di gruppo specifica, si verifica con titoli inferiori. I sieri adsorbiti non danno una reazione di gruppo.

4. Va tenuto presente che gli anticorpi specifici dopo una malattia e anche dopo le vaccinazioni possono persistere a lungo. Si chiamano "anamnestici". Per distinguerli dagli anticorpi “infettivi” formatisi durante la malattia in corso, la reazione viene eseguita dinamicamente, cioè viene esaminato il siero del paziente, prelevato nuovamente dopo 5-7 giorni. Un aumento del titolo anticorpale indica la presenza di una malattia; il titolo degli anticorpi “anamnestici” non aumenta, ma può addirittura diminuire.

Domande di controllo

1. Cosa sono le reazioni immunitarie, quali sono le loro principali proprietà?

2. Quali componenti sono coinvolti nelle reazioni sierologiche? Perché le reazioni sono chiamate sierologiche e da quante fasi sono composte?

3. Cos'è una reazione di agglutinazione? Il suo utilizzo e le modalità di attuazione. Cos'è un diagnosticum?

4. Quale antigene viene utilizzato quando si esamina il siero di un paziente? Quale siero viene utilizzato per determinare il tipo di microbo sconosciuto?

5. Cos'è l'agglutinazione O e H? In quali casi si forma il sedimento flocculante e quando è a grana fine?

Esercizio

1. Eseguire un test di agglutinazione dettagliato per determinare il titolo anticorpale nel siero del paziente e tenere conto del suo risultato.

2. Eseguire una reazione di agglutinazione sul vetro per determinare il tipo di microrganismo isolato.

Reazione di emoagglutinazione

Nella pratica di laboratorio vengono utilizzate due reazioni di emoagglutinazione (HRA) che differiscono nel loro meccanismo d'azione.

Prima RGAA si riferisce al sierologico. In questa reazione, i globuli rossi vengono agglutinati quando interagiscono con anticorpi appropriati (emoagglutinine). La reazione è ampiamente utilizzata per determinare i gruppi sanguigni.

Seconda RGA non è sierologico. In esso, l'incollaggio dei globuli rossi non è causato da anticorpi, ma da sostanze speciali formate da virus. Ad esempio, il virus dell'influenza agglutina i globuli rossi dei polli e dei porcellini d'India, mentre il virus della poliomielite agglutina i globuli rossi delle pecore. Questa reazione consente di giudicare la presenza di un particolare virus nel materiale in esame.

Impostazione di una reazione. La reazione viene condotta in provette o su apposite piastre con pozzetti. Il materiale analizzato per la presenza del virus viene diluito con una soluzione isotonica da 1:10 a 1:1280; 0,5 ml di ciascuna diluizione vengono miscelati con un volume uguale di sospensione di globuli rossi all'1-2%. Nel controllo, 0,5 ml di eritrociti vengono miscelati con 0,5 ml di soluzione isotonica. Le provette vengono poste in un termostato per 30 minuti e le piastre vengono lasciate a temperatura ambiente per 45 minuti.

Contabilità dei risultati. Se la reazione è positiva, sul fondo della provetta o del pozzetto appare un sedimento di globuli rossi con bordi smerlati (“ombrello”), che copre l'intero fondo del pozzetto. Se il risultato è negativo, i globuli rossi formano un sedimento denso con bordi lisci (“bottone”). Lo stesso sedimento dovrebbe essere nel controllo. L'intensità della reazione è espressa dai segni più. Il titolo del virus è la diluizione massima del materiale in cui avviene l'agglutinazione.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

Si tratta di una reazione sierologica in cui specifici anticorpi antivirali, interagendo con il virus (antigene), lo neutralizzano e lo privano della capacità di agglutinare i globuli rossi, cioè inibiscono la reazione di emoagglutinazione. L'elevata specificità della reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI) ne consente l'utilizzo per determinare il tipo e persino il tipo di virus rilevati durante il test HRA.

Impostazione di una reazione. 0,25 ml di siero antivirale in successive diluizioni doppie da 1:10 a 1:2560 vengono miscelati con un uguale volume di materiale contenente il virus, diluito 4 volte inferiore al titolo stabilito nella RGA. La miscela viene agitata e posta in termostato per 30 minuti, dopodiché vengono aggiunti 0,5 ml di una sospensione di globuli rossi all'1-2%.

La reazione è accompagnata da tre controlli (Tabella 17).

I risultati vengono registrati dopo ripetute incubazioni in termostato per 30 o 45 minuti a temperatura ambiente. Se l'esperimento viene eseguito correttamente, dovrebbe formarsi un "pulsante" nel controllo del siero e degli eritrociti: non esiste alcun fattore che agglutina gli eritrociti; nel controllo dell'antigene si forma un "ombrello": il virus ha causato l'agglutinazione dei globuli rossi.

In un esperimento, se il siero è omologo al virus studiato, si forma un “bottone”: il siero ha neutralizzato il virus. Il titolo del siero corrisponde alla diluizione massima alla quale viene ritardata l'emoagglutinazione.

Reazione di emoagglutinazione indiretta

La reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva) (IRHA) si basa sul fatto che i globuli rossi, se un antigene solubile viene adsorbito sulla loro superficie, acquisiscono la capacità di agglutinarsi quando interagiscono con gli anticorpi contro l'antigene adsorbito. Il diagramma RNGA è mostrato in Fig. 34. L'RNGA è ampiamente utilizzato nella diagnosi di numerose infezioni.

Impostazione di una reazione. Il siero in esame viene riscaldato per 30 minuti a 56° C, diluito sequenzialmente in un rapporto di 1:10 - 1:1280 e versato in 0,25 ml in provette o pozzetti, dove 2 gocce di eritrociti diagnostici (eritrociti con antigene adsorbito su di essi ) vengono poi aggiunti.

Controlli: sospensione di eritrociti diagnostici con siero immune noto; sospensione del diagnosticum con siero normale; una sospensione di globuli rossi normali con siero in esame. Nel primo controllo dovrebbe verificarsi l'agglutinazione, nel secondo e nel terzo non dovrebbe verificarsi.

Utilizzando RIGA, è possibile rilevare un antigene sconosciuto se gli anticorpi noti vengono adsorbiti sui globuli rossi.

La reazione di emoagglutinazione può essere eseguita in un volume di 0,025 ml (metodo micro) utilizzando un microtitolatore Takachi.

Domande di controllo

1. Cosa indica un risultato positivo dell'analisi radiografica tra i globuli rossi e il materiale analizzato per la presenza del virus?

2. Si verificherà l'agglutinazione dei globuli rossi se ad essi viene aggiunto un virus e il siero corrispondente? Qual è il nome della reazione che rivela questo fenomeno?

Esercizio

Prendere in considerazione e registrare il risultato RIGA.

Reazione di precipitazione

Nella reazione di precipitazione viene precipitato un complesso immunitario specifico, costituito da un antigene solubile (lisato, estratto, aptene) e un anticorpo specifico in presenza di elettroliti.

L'anello torbido o il precipitato formatosi come risultato di questa reazione è chiamato precipitato. Questa reazione differisce principalmente dalla reazione di agglutinazione per la dimensione delle particelle di antigene.

La reazione di precipitazione viene solitamente utilizzata per determinare l'antigene nella diagnosi di numerose infezioni (antrace, meningite, ecc.); in medicina legale - per determinare le specie di sangue, sperma, ecc .; negli studi sanitari e igienici - quando si stabilisce la falsificazione dei prodotti; con il suo aiuto viene determinata la relazione filogenetica di animali e piante. Per la reazione di cui hai bisogno:

1. Anticorpi (precipitine) - siero immune con un titolo anticorpale elevato (non inferiore a 1:100.000). Il titolo del siero precipitante è determinato dalla massima diluizione dell'antigene con cui reagisce. Il siero viene solitamente utilizzato non diluito o in una diluizione di 1:5 - 1:10.

2. Antigene: sostanze disciolte di natura proteica o polisaccaridica lipidica (antigeni completi e apteni).

3. Soluzione isotonica.

I principali metodi per effettuare la reazione di precipitazione sono: reazione di precipitazione ad anello e reazione di precipitazione in agar (gel).

Attenzione! Tutti i componenti coinvolti nella reazione di precipitazione devono essere completamente trasparenti.

Reazione di precipitazione dell'anello. Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere 0,2-0,3 ml (5-6 gocce) di siero nella provetta di precipitazione (il siero non deve depositarsi sulle pareti della provetta). L'antigene nello stesso volume viene accuratamente stratificato sul siero, versandolo con una sottile pipetta Pasteur lungo la parete della provetta. La provetta viene mantenuta in posizione inclinata. Se stratificato correttamente, dovrebbe esserci un confine chiaro tra il siero e l'antigene. Con attenzione, per non mescolare il liquido, posizionare la provetta su un supporto. Se la reazione è positiva, all'interfaccia tra antigene e anticorpo si forma un "anello" torbido - un precipitato (vedere Fig. 48).

La reazione è accompagnata da una serie di controlli (Tabella 18). La sequenza di aggiunta degli ingredienti di reazione nella provetta è molto importante. Non è possibile stratificare il siero sull'antigene (nel controllo - su una soluzione isotonica), poiché la densità relativa del siero è maggiore, affonderà sul fondo della provetta e il confine tra i liquidi non verrà rivelato.

Nota. + presenza di un “anello”; - assenza di un “anello”.

I risultati si registrano dopo 5-30 minuti, in alcuni casi dopo un'ora, iniziando come sempre dai controlli. L'anello nella seconda provetta indica la capacità del siero immunitario di entrare in una reazione specifica con l'antigene corrispondente. Non dovrebbero esserci "anelli" nelle provette 3-5: non ci sono anticorpi e antigeni corrispondenti tra loro. Un "anello" nella 1a provetta - un risultato di reazione positivo - indica che l'antigene del test corrisponde al siero immunitario prelevato, l'assenza di un "anello" (un "anello" solo nella 2a provetta) indica la loro incoerenza - un risultato negativo risultato della reazione.

Reazione di precipitazione in agar (gel). La particolarità della reazione è che l'interazione tra antigene e anticorpo avviene in un mezzo denso, cioè in un gel. Il precipitato risultante dà una striscia torbida nello spessore del mezzo. L'assenza di una banda indica una discrepanza tra i componenti della reazione. Questa reazione è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica, in particolare nello studio della formazione di tossine nell'agente eziologico della difterite.

Domande di controllo

1. Qual è la differenza principale tra le reazioni di agglutinazione e di precipitazione?

2. Perché non è possibile utilizzare ingredienti torbidi nella reazione di precipitazione?

Esercizio

1. Impostare la reazione di precipitazione dell'anello e disegnare il risultato.

2. Studia la natura dell'interazione dell'antigene con l'anticorpo nella reazione di precipitazione nell'agar, disegna il risultato (prendi una tazza dal tuo insegnante).

Reazione di lisi (citolisi immunitaria)

La lisi immunitaria è la dissoluzione delle cellule sotto l'influenza di anticorpi con la partecipazione obbligatoria del complemento. Per la reazione di cui hai bisogno:

1. Antigene: microbi, globuli rossi o altre cellule.

2. Anticorpo (lisina) - siero immunitario, meno spesso siero del paziente. Il siero batteriolitico contiene anticorpi coinvolti nella lisi dei batteri; emolitico - emolisine che promuovono la lisi dei globuli rossi; per la lisi delle spirochete sono necessarie spirochetolisine, cellule - itolisine, ecc.

3. Complemento. Il siero delle cavie contiene la maggior parte del complemento. Questo siero (una miscela di diversi animali) viene solitamente utilizzato come complemento. Il complemento fresco (nativo) è instabile e facilmente distrutto dal riscaldamento, dall'agitazione o dalla conservazione, quindi può essere utilizzato non più di due giorni dopo il ricevimento. Per preservare il complemento, vengono aggiunti il ​​2% di acido borico e il 3% di solfato di sodio. Questo complemento può essere conservato a 4°C per un massimo di due settimane. Il complemento secco viene spesso utilizzato. Prima dell'uso si scioglie in una soluzione isotonica al volume originale (indicato in etichetta).

4. Soluzione isotonica.

Reazione di emolisi(Tabella 19). Per la reazione di cui hai bisogno:

1. Antigene - Sospensione al 3% di eritrociti di pecora lavati in ragione di 0,3 ml di sedimento eritrocitario e 9,7 ml di soluzione isotonica.

2. Anticorpo - siero emolitico (emolisina) contro eritrociti di pecora; solitamente preparato in produzione, liofilizzato e con il titolo indicato in etichetta.

Il titolo di emolisina è la più alta diluizione del siero alla quale si verifica l'emolisi completa di una sospensione al 3% di globuli rossi in presenza di complemento. Per la reazione di emolisi l'emolisina viene assunta a titolo triplo, cioè diluita 3 volte meno rispetto a prima del titolo. Ad esempio, con un titolo sierico di 1:1200, il siero viene diluito 1:400 (0,1 ml di siero * e 39,9 ml di soluzione isotonica). È necessario un eccesso di emolisina poiché parte di essa può essere adsorbita da altri componenti della reazione.

* (Non dovresti assumere meno di 0,1 ml di siero: la precisione della misurazione ne risentirà.)

3. Il complemento viene diluito 1:10 (0,2 ml di complemento e 1,8 ml di soluzione isotonica).

4. Soluzione isotonica.

Contabilità dei risultati. Se la reazione viene eseguita correttamente, nella prima provetta si verificherà l'emolisi: il suo contenuto diventerà trasparente. Nei controlli il liquido rimane torbido: nella 2a provetta non c'è abbastanza complemento perché avvenga l'emolisi, nella 3a provetta non c'è emolisina, nella 4a provetta non c'è né emolisina né complemento, nella 5a provetta l'antigene non c'è non corrispondere all'anticorpo,

Se necessario, il siero emolitico viene titolato secondo il seguente schema (Tabella 20).

Prima della titolazione, preparare una prima diluizione del siero 1:100 (0,1 ml di siero e 9,9 ml di soluzione isotonica), da cui ricavare le diluizioni necessarie, ad esempio:

Da queste diluizioni, aggiungere 0,5 ml di siero nelle provette di titolazione, come mostrato nella tabella. 20.

Nell'esempio riportato nella tabella. 20, il titolo del siero emolitico è 1:1200.

Quando si utilizza il siero emolitico fresco, è necessario inattivarlo per distruggere il complemento in esso presente. Per fare ciò si riscalda per 30 minuti a 56 ° C a bagnomaria o in un inattivatore dotato di termostato. Quest’ultimo metodo è migliore: elimina la possibilità di surriscaldamento del siero, cioè la sua denaturazione. I sieri denaturati non sono adatti per il test.

Reazione di batteriolisi. In questa reazione, il complemento lisa i batteri in presenza di siero appropriato (omologo). Lo schema di reazione è fondamentalmente simile allo schema di reazione dell'emolisi. La differenza è che dopo un'incubazione di due ore, tutte le provette vengono seminate su piastre Petri con un terreno favorevole affinché il microrganismo portato nell'esperimento possa verificare se è lisato. Se l'esperimento viene eseguito correttamente, le colture di 2-5 provette (controlli) dovrebbero mostrare una crescita abbondante. La mancata crescita o la crescita debole nell'inoculazione della prima provetta (esperimento) indica la morte dei microbi, cioè che sono omologhi all'anticorpo.

Attenzione! La reazione di batteriolisi deve essere condotta in condizioni asettiche.

Domande di controllo

1. Cosa accadrebbe ai globuli rossi se si utilizzasse acqua distillata invece della soluzione isotonica di cloruro di sodio? Qual è la base di questo fenomeno?

2. Quale reazione si verificherà quando gli eritrociti interagiscono con il siero immunitario omologo in assenza di complemento?

Esercizio

Impostare la reazione di emolisi. Registra e disegna il risultato.

Reazione di fissazione del complemento

La reazione di fissazione del complemento (CFR) si basa sul fatto che uno specifico complesso antigene-anticorpo adsorbe (si lega) sempre il complemento a se stesso.

Questa reazione è ampiamente utilizzata nell'identificazione degli antigeni e nella sierodiagnosi delle infezioni, in particolare delle malattie causate da spirochete (reazione di Wassermann), rickettsie e virus.

La RSC è una reazione sierologica complessa. Coinvolge il complemento e due sistemi antigene-anticorpo. Si tratta essenzialmente di due reazioni sierologiche.

Il primo sistema, quello principale, è costituito da un antigene e da un anticorpo (uno è noto, l'altro no). Ad esso viene aggiunta una certa quantità di complemento. Se l'antigene e l'anticorpo di questo sistema corrispondono, si collegheranno e legheranno il complemento. Il complesso risultante è finemente disperso e non visibile.

La formazione di questo complesso viene rilevata utilizzando un secondo sistema emolitico o indicatore. Comprende i globuli rossi di pecora (antigene) e il corrispondente siero emolitico (anticorpo), cioè un complesso immunitario già pronto. In questo sistema, la lisi dei globuli rossi può avvenire solo in presenza del complemento. Se il complemento è legato al primo sistema (se l'antigene e l'anticorpo corrispondono in esso), nel secondo sistema non si verificherà emolisi, poiché non esiste complemento libero. L'assenza di emolisi (il contenuto della provetta è torbido o sul fondo è presente un sedimento di globuli rossi) viene registrata come risultato positivo della RSC (Fig. 35).

Se nel primo sistema l'antigene non corrisponde all'anticorpo, il complesso immunitario non si formerà e il complemento rimarrà libero. Rimanendo libero, il complemento partecipa al secondo sistema, provocando l'emolisi - il risultato dell'RSC è negativo (il contenuto delle provette è trasparente - “sangue laccato”).

Componenti della reazione di fissazione del complemento: 1. Antigene - solitamente lisato, estratto, aptene; sospensione di microrganismi Principale 2. Anticorpo - sistema siero paziente 3. Complemento - siero di cavia 4. Antigene - globuli rossi di pecora Emoliti- 5. Anticorpo - emolisina verso globuli rossi di pecora 6. Sistema di soluzione isotonica

A causa del fatto che nella RSC sono coinvolti un gran numero di componenti complessi, devono prima essere titolati e inseriti nella reazione in quantità esatte e in volumi uguali: 0,5 o 0,25, meno spesso 0,2 ml. Di conseguenza, l'intero esperimento viene eseguito in volumi di 2,5, 1,25 o 1,0 ml (volumi maggiori danno un risultato più accurato). La titolazione dei componenti della reazione viene effettuata nello stesso volume dell'esperimento, sostituendo gli ingredienti mancanti con una soluzione isotonica.

Preparazione degli ingredienti

1. Siero emolitico(emolisina). Il siero è diluito 3 volte meno del suo titolo. Preparare una diluizione generale del siero per l'intero esperimento; il cui volume viene determinato moltiplicando il volume di siero in una provetta (ad esempio 0,5 ml) per il numero di provette, leggermente superiore al numero nell'esperimento *.

* (Il liquido in eccesso è necessario quando si preparano tutti i componenti della reazione: parte di esso rimane sulle pareti delle provette, dei matracci e delle pipette.)

2. Globuli rossi di pecora. Preparare una sospensione al 3% di eritrociti di pecora lavati per l'intero numero di provette dell'esperimento.

Per preparare il sistema emolitico, 30 minuti prima di introdurlo nell'esperimento, mescolare volumi uguali di emolisina diluita e una sospensione di globuli rossi, versare il siero nei globuli rossi, mescolare accuratamente e incubare per 30 minuti a 37°C ( sensibilizzare).

3. Complemento solitamente diluito 1:10. Deve essere titolato prima di ogni esperimento. Il titolo del complemento è la sua quantità più piccola, quando aggiunto al sistema emolitico, l'emolisi completa avviene entro 1 ora a 37 ° C. Lo schema di titolazione del complemento è presentato nella tabella. 21.

Nota. Il volume totale del liquido nelle provette è di 2,5 ml.

Attenzione! Il complemento viene titolato nello stesso volume dell'esperimento principale, sostituendo gli ingredienti mancanti con una soluzione isotonica.

Contabilità dei risultati. Nei controlli non dovrebbero esserci nemmeno tracce di emolisi, poiché uno di essi non contiene complemento, l'altro - emolisina. I controlli indicano che i componenti della reazione non presentano emototossicità (la capacità di lisare spontaneamente i globuli rossi).

Nella tabella riportata Nell'esempio 21, il titolo del complemento ad una diluizione di 1:10 è 0,15 ml. In un esperimento, l'attività del complemento può diminuire a causa del suo adsorbimento non specifico da parte di altri componenti della reazione, pertanto, per l'esperimento, la quantità di complemento viene aumentata: viene prelevata la dose successiva al titolo. Questa è la dose di lavoro. Nell'esempio riportato equivale a 0,2 ml di complemento alla diluizione 1:10. Poiché tutti i componenti coinvolti nella RSC devono essere assunti in volumi uguali (nel nostro esempio è 0,5 ml), è necessario aggiungere 0,3 ml di una soluzione isotonica alla dose di lavoro del complemento (0,2 ml 1:10). Per l'intero esperimento, il volume di ciascuno di essi (complemento e soluzione isotonica) viene moltiplicato per il numero di provette partecipanti all'RSC. Ad esempio, per condurre un esperimento in 50 provette, è necessario prendere 10 ml di complemento 1:10 (0,2 ml × 50) e 15 ml di soluzione isotonica (0,3 ml × 50).

4. Antigene solitamente si ottiene già pronto con l'indicazione del suo titolo, cioè della quantità che, dopo aver diluito l'antigene, dovrebbe essere contenuta in 1 ml. Ad esempio, con un titolo di 0,4, viene diluito in 0,96 ml di soluzione isotonica. Nell'esperimento viene prelevata una quantità di antigene pari alla metà del titolo (0,5 ml). Questa è la sua dose di lavoro. Preparare una diluizione generale dell'antigene per l'intero esperimento, moltiplicando 0,5 ml per il numero di provette nell'esperimento.

5. Anticorpo- siero del paziente. Il siero fresco viene inattivato prima dell'esperimento per distruggere il complemento presente in esso. Per fare ciò si riscalda per 30 minuti a 56 ° C a bagnomaria o in un inattivatore dotato di termostato. È preferibile quest’ultimo metodo: elimina la possibilità di surriscaldamento del siero, cioè la sua denaturazione. I sieri denaturati non sono adatti per il test. Il siero del paziente viene solitamente utilizzato in una diluizione da 1:10 a 1:160.

I sieri immuni sono spesso preparati in condizioni di produzione e rilasciati inattivati. Sono diluiti 1:50 e oltre.

Attenzione! Tutti gli ingredienti sono preparati in leggero eccesso.

Condurre l'esperimento principale

Quando si imposta un esperimento, la sequenza di aggiunta dei componenti è estremamente importante. L'esperimento si svolge in due fasi (Tabella 22).

1 (Negli esperimenti, il siero può essere studiato in diluizioni seriali doppie.)

Fase I. Nelle provette viene versata la quantità necessaria di soluzione isotonica di cloruro di sodio, quindi il volume richiesto di siero diluito e le dosi di lavoro di antigene e complemento nello stesso volume. L'esperimento deve essere accompagnato dal controllo di tutti gli ingredienti in esso coinvolti: siero, antigene, sistema emolitico e complemento.

Le provette vengono accuratamente agitate e incubate a 37°C per 45 minuti - 1 ora o a 4°C (“RSK al freddo”) per 18 ore durante le quali, in presenza di un complesso specifico, avviene il legame del complemento. L'esecuzione della reazione “a freddo” ne aumenta notevolmente la sensibilità e la specificità.

Fase II. Al termine dell'incubazione, in tutte le provette viene aggiunto 1 ml di sistema emolitico, che viene preliminarmente mantenuto in termostato per 30 minuti (sensibilizzato). Le provette vengono agitate e riposte nel termostato.

Contabilità dei risultati. Le provette vengono lasciate nel termostato fino alla completa emolisi nelle provette 2, 3, 6 e 7 (controllo del siero, dell'antigene e del complemento per una e due dosi). L'emolisi avverrà prima nella settima provetta, che contiene una quantità doppia di complemento. Dopo che si è verificata l'emolisi in questa provetta e il suo contenuto è diventato completamente trasparente, è necessario monitorare con particolare attenzione i restanti controlli. Non appena il liquido nella 2a, 3a e 6a provetta diventa trasparente, rimuovere immediatamente il portaprovette dal termostato. Il fatto che l'esperimento non sia stato tenuto nel termostato più a lungo del necessario è indicato dalla presenza di una leggera torbidità (emolisi incompleta) nella 5a provetta: contiene solo metà della dose di lavoro del complemento e l'emolisi completa non può verificarsi se l'esperimento viene impostare correttamente.

L'emolisi nel siero e nel controllo dell'antigene (provette 2 e 3) indica che le dosi sono state scelte correttamente e che né il siero né l'antigene si legano al complemento.

Nel controllo del sistema emolitico (provetta 4), se funziona correttamente, non dovrebbero esserci nemmeno tracce di emolisi - non contiene alcun complemento.

Una volta che sei sicuro che i controlli siano stati completati correttamente, puoi prendere in considerazione l'esperienza. L'assenza di emolisi nelle provette è considerata un risultato positivo della reazione. Indica che il siero contiene anticorpi specifici per l'antigene prelevato. Il complesso formato da loro legava il complemento e ne impediva la partecipazione alla reazione di emolisi. Se si verifica emolisi nelle provette, il risultato della reazione viene valutato come negativo. In questo caso non c'è corrispondenza tra antigene e anticorpo; il complemento non è legato ed è coinvolto nella reazione di emolisi.

Parallelamente al siero del paziente, lo stesso esperimento viene eseguito con siero ovviamente positivo (cioè con siero che contiene anticorpi contro un determinato antigene) e siero ovviamente negativo, che non contiene anticorpi specifici. Se l'esperimento è impostato correttamente, nel primo caso dovrebbe verificarsi un ritardo nell'emolisi, nel secondo caso si verificherà l'emolisi.

L'intensità della reazione è espressa come segue:

Ritardo completo dell'emolisi. I globuli rossi formano una torbidità uniforme o si depositano sul fondo. In questo caso il liquido nella provetta diventa incolore;

Circa il 25% dei globuli rossi viene lisato. C'è meno sedimento, il liquido sopra è leggermente rosa. Anche il risultato del RSC è valutato fortemente positivo;

Circa il 50% dei globuli rossi viene lisato. Il sedimento è piccolo, il liquido è rosa. Risultato RSC positivo;

Circa il 75% dei globuli rossi viene lisato. Un leggero sedimento, sopra il quale si trova un liquido dal colore intenso. Risultato RSC discutibile;

Tutti i globuli rossi sono stati lisati. Il liquido è intensamente colorato e completamente trasparente. Risultato RSK negativo.

Domande di controllo

1. Qual è il principio dell'RSK?

2. Quali sistemi sono coinvolti nel DSC? In cosa consiste il sistema emolitico e che ruolo gioca nella reazione?

3. Qual è la preparazione per l'esperienza principale dell'RSK? In quale sequenza viene effettuato? Quante fasi ci sono nel DGC?

4. Cosa indica l'assenza di emolisi nelle RSC?

Esercizio

1. Titolare il complemento e impostarne la dose di lavoro.

2. Calcola tutti gli ingredienti per impostare l'esperimento principale, conduci l'esperimento, prendi in considerazione e disegna il risultato.

Reazione di immunofluorescenza

La reazione di immunofluorescenza (IFR) utilizza la microscopia a fluorescenza (vedere Capitolo 2) per gli studi sierologici. La reazione si basa sul fatto che i sieri immunitari, ai quali sono attaccati chimicamente i fluorocromi, quando interagiscono con i corrispondenti antigeni, formano uno specifico complesso luminoso, visibile al microscopio a fluorescenza. Tali sieri sono chiamati luminescenti*. Il metodo è altamente sensibile, semplice e non richiede l'isolamento di una coltura pura (i microrganismi possono essere rilevati direttamente nel materiale del paziente: feci per il colera, espettorato per pertosse, tessuto cerebrale per la rabbia). Il risultato può essere ottenuto mezz'ora dopo aver applicato il siero luminescente sul preparato. Pertanto, il RIF è ampiamente utilizzato nella diagnosi espressa (accelerata) di una serie di infezioni.

* (Fluorocromi: la fluoresceina dà un bagliore verde, la rodamina dà un bagliore rosso.)

Per preparare i preparati, un vetrino con uno striscio fisso (impronta, sezione) viene posto in una camera umida. La camera è preparata come segue. La carta da filtro bagnata viene posizionata sul fondo della capsula Petri. Parallelamente vengono poste due bacchette di vetro (è possibile utilizzare la parte larga delle pipette Pasteur). Su di essi viene posizionato un vetrino e imbrattato.

Attenzione! Non dimenticare di tracciare il tratto sul retro con una matita di cera.

Sullo striscio viene applicata una goccia di siero luminescente. Chiudete la tazza e mettetela in un termostato o lasciatela a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Dopo l'incubazione, vengono lavati con una soluzione isotonica tamponata (pH 7,4), risciacquati con acqua distillata, asciugati, viene applicata una goccia di glicerolo tamponato, coperti con un vetrino coprioggetto (non più spesso di 0,17 mm!) ed esaminati al microscopio a fluorescenza. Se il preparato contiene microbi omologhi agli anticorpi del siero luminescente, questi si illuminano intensamente su uno sfondo scuro. Questo metodo è chiamato diretto (Fig. 36). Lo svantaggio del metodo RIF diretto è che richiede sieri luminescenti per ciascun antigene rilevabile, che sono difficili da preparare, e non esiste un set completo di sieri luminescenti già pronti per ciascun antigene. Pertanto, viene spesso utilizzato il metodo indiretto. Consiste nel fatto che nella prima fase il farmaco viene trattato con siero immunitario non luminescente specifico per l'antigene desiderato. Se il farmaco contiene gli antigeni desiderati (microbi), si forma un complesso antigene-anticorpo che non può essere visto. Dopo l'essiccazione, nella seconda fase, il preparato viene trattato con siero luminescente contenente anticorpi non contro l'antigene desiderato, ma contro globuline della specie animale da cui è stato ottenuto il siero specifico. Ad esempio, se il primo siero è stato ottenuto immunizzando un coniglio, il secondo dovrebbe contenere anticorpi contro le globuline di coniglio (vedi Fig. 36). Questi anticorpi si combinano con specifiche globuline sieriche che vengono adsorbite sull'antigene desiderato e il complesso si illumina quando il preparato viene osservato al microscopio a fluorescenza.

Reazione opsonofagocitica

La reazione opsonofagocitica (OPR) è uno dei metodi per valutare l'attività della fagocitosi immunitaria. Maggiore è questa attività, maggiore è la resistenza del corpo alle infezioni. Nell'organismo immunitario, sotto l'influenza di anticorpi (opsonine), la fagocitosi avviene più attivamente (più microbi vengono assorbiti in un periodo di tempo più breve). Pertanto, gli indicatori di attività fagocitica non hanno solo valore diagnostico (ad esempio nella brucellosi), ma consentono anche di prevedere l'esito del processo infettivo, valutare i risultati del trattamento e della vaccinazione. Per la reazione di cui hai bisogno:

1. Antigene: una sospensione di microrganismi vivi o uccisi.

2. Anticorpo (opsonine): siero da testare.

3. Fagociti: solitamente neutrofili del sangue sottoposto a test.

Impostazione di una reazione. Utilizzando una micropipetta, 0,05 ml di soluzione di citrato di sodio al 2% vengono versati in piccole provette; 0,1 ml di sangue da analizzare e 0,05 ml di una sospensione di microrganismi, la cui densità corrisponde a 10 unità in 1 ml. torbidità secondo lo standard ottico GISC.

Attenzione! Per ciascun ingrediente deve essere utilizzata una pipetta separata.

Il contenuto delle provette viene miscelato. Le provette vengono poste in un termostato per 30 minuti, dopodiché il loro contenuto viene nuovamente miscelato e vengono preparati strisci sottili (come strisci di sangue). Colorazione secondo Romanovsky - Giemsa.

Contabilità dei risultati. Vengono contati 25 neutrofili in punti diversi dello striscio, tenendo conto del numero di microrganismi catturati in ciascuno di essi. L'indice di reazione opsonofagocitica (POFR) si calcola utilizzando la formula:

POFR = 3a + 2b + 1c + 0,

dove a è il numero di neutrofili contenenti più di 41 batteri; b - il numero di neutrofili contenenti da 21 a 40 batteri; c è il numero di neutrofili contenenti da 1 a 20 batteri; 0 - il numero di neutrofili che non contengono batteri.

L'indicatore massimo della reazione opsonofagocitica con questo sistema contabile è 75.

Il risultato della reazione viene valutato secondo il seguente schema:

con POFR da 1 a 24 - debolmente positivo;

con POFR da 25 a 49 - chiaramente espresso;

con POFR da 50 a 75 - nettamente positivo.

Nelle persone sane, il POFR è 0-1, raramente 4-5. Risultati chiaramente espressi e nettamente positivi della reazione indicano un elevato effetto opsonizzante del siero della persona esaminata con un'attività pronunciata dei fagociti del sangue.

La determinazione della sola attività degli anticorpi - opsonine - viene effettuata mediante l'esperienza di determinazione dell'indice opsoico - il rapporto tra l'indicatore fagocitico in presenza di siero immunitario (test) e l'indicatore fagocitico nel siero che non contiene anticorpi contro un dato microbo. L'esperimento si effettua nel seguente modo: si prelevano 2 provette, in una delle quali (quella sperimentale) si aggiungono in quantità uguali (solitamente 0,2 ml): 1) siero della persona in esame; 2) una sospensione di microbi, in cui viene determinata la presenza di opsonine; 3) leucociti (possono provenire dalla cavità addominale di un topo). Alla provetta controllo viene aggiunto: 1) siero senza opsonine (controllo); 2) gli stessi microbi di quello sperimentale; 3) leucociti (gli stessi della provetta).

Entrambe le provette vengono mantenute in un termostato per 30 minuti, quindi da entrambe le provette vengono preparati degli strisci, fissati e colorati secondo Romanovsky-Giemsa. Gli strisci vengono esaminati al microscopio e l'indice fagocitico viene determinato nelle provette di test e di controllo.

Se nel siero in esame sono presenti opsonine, l'indice opsonico sarà maggiore di uno. Maggiore è il numero ottenuto dividendo l'indicatore di fagocitosi del siero in esame per l'indicatore fagocitico del siero di controllo, più pronunciato è l'effetto degli anticorpi - opsonine.

Domande di controllo

1. Su quali proprietà degli anticorpi si basa l'ODF? Questa reazione è specifica?

2. Cosa indica un GFR di 75?

Esercizio

Esaminare l'ODF del sangue prelevato da un dito. Disegna i fagociti. Calcola PORF.

Reazioni immunitarie in vivo (test cutanei)

Quando l'antigene viene applicato sulla pelle scarificata o somministrato per via intradermica, è possibile rilevare sia uno stato immunitario che uno stato di ipersensibilità ad un determinato farmaco.

Test cutaneo con tossina. Una quantità titolata di tossina viene iniettata per via intradermica. Se il corpo è immune, cioè ha un certo livello di antitossina, l'effetto della tossina non si manifesterà: la tossina verrà neutralizzata dall'antitossina. In un organismo non immune si svilupperà un infiltrato infiammatorio (arrossamento, ispessimento, ecc.) nel sito di iniezione della tossina.

Test cutanei per allergeni(test allergici cutanei) per studiare l’aumento delle reazioni (vedere Capitolo 13). Con l'ipersensibilità immediata, l'allergene introdotto (antigene) reagisce con gli anticorpi adsorbiti sulle cellule di vari organi. L'aumento della sensibilità di tipo ritardato è dovuto alla reazione dei linfociti T sensibilizzati all'allergene. Tale sensibilizzazione si verifica con una serie di infezioni in pazienti che sono stati malati e vaccinati (tubercolosi, brucellosi, ecc.). Pertanto, i test allergici cutanei per queste infezioni hanno valore diagnostico.

I preparativi per i test cutanei sono preparati da produttori speciali, fornendo istruzioni per il loro uso.

Domande di controllo

1. Qual è l'anticorpo nel test cutaneo per le tossine? Cosa indica il risultato negativo di questo test?

2. Quale reazione ci consente di identificare uno stato di maggiore sensibilità del corpo a un agente infettivo?

Immunoprofilassi e immunoterapia delle malattie infettive

I tentativi di prevenire il decorso grave di una malattia mortale causando una forma lieve della malattia sono stati fatti per secoli in diversi paesi del mondo.

La base scientifica e l'implementazione pratica dell'immunoprofilassi furono fornite per la prima volta da L. Pasteur, che creò i principi dell'uso di microrganismi indeboliti (attenuati) e preparati farmaci (vaccini) per prevenire alcune malattie infettive dell'uomo e degli animali.

Sono passati più di cento anni e ora la creazione artificiale dell'immunità è la base per la lotta contro le malattie infettive.

L'immunizzazione - la somministrazione di farmaci per creare un'immunità attiva artificiale - viene effettuata in determinati anni durante la vita di una persona. Nei primi giorni dopo la nascita, il bambino riceve il vaccino BCG contro la tubercolosi. Nel 1 ° anno di vita viene vaccinato per prevenire le malattie di difterite, pertosse e tetano, vaccinato contro la poliomielite, il morbillo, ecc. In questo modo viene effettuata una prevenzione specifica delle malattie infettive, per le quali vengono utilizzati i vaccini.

Vaccini- i preparativi per l'immunizzazione attiva possono essere:

1. Corpuscolare (da cellule microbiche) - vivi e morti.

2. Chimico (antigeni e frazioni antigeniche).

3. Anatossine.

I vaccini vivi attenuati sono preparati da microrganismi viventi, la cui virulenza è indebolita (dal latino attenuatore - indebolire, ammorbidire) e le proprietà immunogeniche (la capacità di causare immunità) sono preservate.

Esistono diversi modi per ottenere tali microrganismi:

1) coltivazione su terreni nutritivi sfavorevoli per la crescita e la riproduzione dell'agente patogeno; sotto l'influenza di fattori fisici e chimici (è così che è stato ottenuto il vaccino BCG per la prevenzione della tubercolosi); 2) passaggio dell'agente patogeno attraverso il corpo di un animale poco suscettibile a un'infezione riproducibile (è così che L. Pasteur ha ricevuto il vaccino contro la rabbia); 3) selezione di colture naturali di microrganismi poco virulenti per l'uomo (così è stato ottenuto il vaccino contro la peste), ecc.

I vaccini vivi creano un'immunità intensa, poiché provocano un processo simile a quello infettivo naturale, solo lievemente espresso, quasi senza manifestazioni cliniche. In questo caso, viene attivato l'intero meccanismo dell'immunogenesi: viene creata l'immunità.

I vaccini uccisi sono colture di microrganismi inattivati ​​​​dalle alte temperature, sostanze chimiche (fenolo, formaldeide, alcool, acetone), raggi UV, ecc. In questo caso vengono selezionati fattori di esposizione che preservano completamente le proprietà immunogeniche delle cellule microbiche.

I vaccini chimici sono componenti individuali di una cellula microbica (antigeni) ottenuti mediante una lavorazione speciale di una sospensione microbica.

I vaccini chimici vengono generalmente assorbiti rapidamente dopo l'introduzione nel corpo, il che non consente di ottenere l'irritazione immunogenica desiderata, quindi ai vaccini vengono aggiunte sostanze che allungano il tempo di assorbimento: idrossido di alluminio, allume di alluminio-potassio, oli minerali, ecc. Questo è chiamato creando un “deposito”.

I vaccini chimici vengono utilizzati per prevenire la febbre tifoide, la meningite, ecc.

Le anatossine (dal latino ana - indietro) sono esotossine di batteri, neutralizzate dall'esposizione alla formaldeide (0,3-0,4%) e dall'esposizione ad una temperatura di 37°C per 3-4 settimane. In questo caso si verifica una perdita delle proprietà tossiche, ma la conservazione di quelle immunogeniche.

Attualmente i tossoidi sono stati ottenuti e utilizzati dalle tossine della difterite, del tetano, ecc.

I tossoidi vengono purificati dalle impurità presenti nei mezzi nutritivi (proteine ​​di zavorra) e adsorbiti su sostanze che vengono assorbite lentamente dal sito di iniezione.

In base al numero di antigeni contenuti nel vaccino si distinguono: monovaccini (da un tipo di antigeni), divaccini (da due antigeni), tre vaccini (da tre antigeni), ecc.

I vaccini associati vengono preparati da antigeni di vari batteri e tossoidi. Ad esempio, il vaccino associato pertosse-difterite-tetano (DTP) contiene germi di pertosse uccisi e tossoidi: difterite e tetano.

I vaccini vengono somministrati per via intramuscolare, sottocutanea, cutanea, intradermica, orale. Immunizzare una, due o tre volte ad intervalli di 1-2 settimane o più. La frequenza di somministrazione e gli intervalli tra le vaccinazioni dipendono dalla natura del vaccino: per ciascuno di essi sono stati sviluppati regimi di somministrazione.

Dopo la somministrazione del vaccino possono verificarsi reazioni generali e locali. I sintomi più comuni includono febbre (fino a 39° C), mal di testa e malessere. Questi fenomeni solitamente scompaiono dopo 2-3 giorni. Reazioni locali: arrossamento e infiltrazione nel sito di somministrazione del vaccino possono comparire 1-2 giorni dopo la vaccinazione. Quando un vaccino viene somministrato per via cutanea (contro la tularemia, il BCG, ecc.), la comparsa di una reazione locale indica l'efficacia della vaccinazione.

Esistono controindicazioni alla vaccinazione: febbre, malattie infettive acute, allergie, ecc. Anche le donne non vengono vaccinate nella seconda metà della gravidanza.

Vaccini e tossoidi vengono preparati nelle fabbriche che producono preparati batterici. La loro produzione richiede grandi quantità di sospensione microbica (biomassa) o di materiale contenente virus.

I preparati finiti vengono versati in fiale o fiale e per lo più essiccati. I preparati secchi mantengono la loro attività e altre proprietà più a lungo.

Alcuni vaccini, come quello antipolio, sono disponibili sotto forma di compresse o pillole.

Ogni fiala, flacone e scatola di farmaci è etichettato con il nome del farmaco, il suo volume, la data di scadenza, il numero di lotto e il numero di controllo.

Le istruzioni per l'uso sono incluse in ogni scatola.

I preparati vengono generalmente conservati ad una temperatura di 4° C. I preparati non devono essere esposti a gelo e scongelamento o ad alte temperature. Durante il trasporto si osservano condizioni speciali. Non utilizzare farmaci che presentano crepe nelle fiale e aspetto modificato.

Nell'URSS esiste un sistema di controllo statale sulla qualità dei preparati medici immunobiologici, che ne garantisce l'efficacia e la standardizzazione.

Un tipo speciale di vaccino – e questo è un vaccino. Sono preparati nei laboratori batteriologici da microbi isolati dal paziente. Un autovaccino viene utilizzato per trattare solo questo paziente. Molto spesso, gli autovaccini vengono utilizzati per trattare le infezioni croniche (stafilococco, ecc.). L’autovaccino viene somministrato ripetutamente, a piccole dosi, secondo un regime sviluppato per ciascun vaccino. Gli autovaccini stimolano le difese dell'organismo, il che contribuisce al recupero.

Preparazioni di siero utilizzato per creare un'immunità passiva artificiale. Questi includono sieri immunitari specifici e immunoglobuline.

Questi farmaci contengono anticorpi già pronti. Sono ottenuti dal sangue di donatori: persone o animali appositamente immunizzati (contro il morbillo, l'influenza, il tetano). Inoltre, viene utilizzato il siero di persone guarite e anche sane se contiene una quantità sufficiente di anticorpi. Il sangue placentare e quello abortivo vengono utilizzati anche come materie prime per la preparazione di preparati immunitari.

Sono disponibili sieri antibatterici e antitossici. I primi hanno un utilizzo più limitato. I sieri antitossici sono usati per trattare la difterite, il tetano, il botulismo, ecc. Questi sieri sono prodotti con un certo contenuto di antitossina, misurato in unità internazionali (UI).

Le preparazioni di siero immunitario sono ottenute dal sangue di animali, principalmente cavalli, che sono stati immunizzati più volte. Al termine dell'immunizzazione, viene determinato il livello di anticorpi nel sangue e viene eseguito il salasso. Il siero risultante viene preservato, la sua sterilità, attività e proprietà fisiche sono controllate.

I preparati ottenuti dal sangue dei cavalli contengono proteine ​​estranee all'uomo che, se somministrate ripetutamente, possono provocare reazioni allergiche: malattia da siero e shock anafilattico. Per prevenire complicazioni, i farmaci sierici devono essere somministrati con precauzioni (secondo Bezredka) (vedi Capitolo 13). Per liberare il siero animale dalle proteine ​​di zavorra e concentrare gli anticorpi, vengono utilizzati vari metodi, il principale dei quali è il metodo Diaferm-3, sviluppato nel nostro paese e comprendente l'idrolisi enzimatica delle proteine ​​di zavorra.

Inoltre, per concentrare gli anticorpi in un volume più piccolo del farmaco, sono stati sviluppati metodi per isolare le gamma globuline contenenti anticorpi dal siero del sangue. Tali farmaci sono chiamati immunoglobuline. Sono preparati da siero umano (omologo) e animale (eterologa).

L’efficacia delle immunoglobuline è molto superiore all’efficacia dei sieri immunitari e si osservano sproporzionatamente meno complicazioni. Attualmente, le immunoglobuline sono utilizzate molto più ampiamente dei sieri.

Nel nostro Paese le immunoglobuline vengono utilizzate per prevenire il morbillo, l'epatite, la rosolia, ecc. La somministrazione profilattica di immunoglobuline viene effettuata quando si sospetta un'infezione o in caso di infezione. Si consiglia di somministrare questi farmaci nei primi giorni dopo l'infezione (l'inizio del periodo di incubazione), mentre il processo patologico non si è ancora sviluppato.

Quando si utilizza il farmaco a scopo terapeutico, la sua somministrazione precoce dà un effetto maggiore.

Sieri e immunoglobuline vengono somministrati per via intramuscolare e endovenosa.

L'uso tempestivo e corretto dei preparati sierici può ridurre l'incidenza di molte infezioni.

Domande di controllo

1. Quali tipi di vaccini conosci?

2. Quali farmaci creano l'immunità passiva?

3. Cos'è un autovaccino?

REAZIONI IMMUNOBIOLOGICHE, si basano sull'interazione di un antigene e un anticorpo presenti nel siero immunitario (secondo le idee di Ehrlich) o di un antigene e un siero modificati appositamente sotto l'influenza dell'irritazione immunizzante (secondo le opinioni più recenti). Le reazioni più importanti sono l'agglutinazione, la precipitazione, la batteriolisi, la reazione di rigetto del complemento e una reazione basata sull'azione delle opsonine. L'aglutinazione e la precipitazione si verificano quando un antigene e il suo corrispondente anticorpo si incontrano; Per effettuare la batteriolisi, la reazione di rigetto del complemento, ecc., oltre all'antigene e all'anticorpo, è necessaria anche la partecipazione del complemento. Il significato di I. reazioni è duplice. Con il loro aiuto è possibile diagnosticare una particolare malattia infettiva mettendo in contatto il siero del paziente con un microbo, l'agente eziologico dell'infezione sospetta (reazione Vidal per la febbre tifoide e la febbre paratifoide, reazione di rigetto del complemento per varie infezioni). Disponendo invece di un siero immune ad una specifica infezione, è possibile identificare un microbo di cui non si conosce la natura. Anche le precipitazioni contano in termini di dignità. e medicina legale pratica, consentendo di determinare la specie dell'animale a cui appartiene il materiale oggetto di studio.

Reazioni immunologiche(IR) sono ampiamente utilizzati nella diagnosi di laboratorio delle infezioni. Sono utilizzati:
1) per rilevare gli anticorpi nel siero del sangue, ad es. nella diagnosi sierologica delle malattie infettive;
2) determinare il tipo o il sierotipo di un microrganismo, ad es. la sua identificazione antigenica.

IR Viene rilevata la formazione del complesso AG-AT. In questo caso la componente sconosciuta viene determinata a partire da quella nota. Gli IR si distinguono per l'elevata sensibilità (legame di AT con AG in quantità trascurabilmente piccole) e specificità (determinata dalle caratteristiche strutturali del centro attivo dei determinanti AT e AG). Sono caratterizzati da fasi di sviluppo. Il primo stadio è specifico, invisibile all'occhio, ed è caratterizzato dalla connessione del gruppo determinante di AG con il centro attivo di AT. Di conseguenza, si forma un complesso AGATA, che ha perso la sua solubilità in soluzioni isotoniche. Il secondo stadio è aspecifico, visibile all'occhio, e la natura della manifestazione dipende dallo stato di AG, AT e dalle condizioni ambientali in cui avviene l'interazione di AG e AT.

Quando gli anticorpi interagiscono con gli antigeni corpuscolari (batteri, cellule animali, altre cellule), si verificano cambiamenti visibili ad occhio nudo (ad esempio scaglie di agglutinazione, lisi cellulare). Se gli AG solubili (finemente dispersi) vengono combinati con AT, la formazione di complessi viene rilevata come risultato dell'adsorbimento preliminare di AG (AT) su sostanze corpuscolari (eritrociti, particelle di carbone, ecc.)

La velocità della reazione dipende da:
- rapporto ottimale tra AG e AT;
- grado di specificità di AG e AT; - pH dell'ambiente (7,2-7,4);
- concentrazioni di elettroliti (0,85% cloruro di sodio).

A seconda dello stato di AG, AT e delle caratteristiche dell'ambiente in cui AG e AT interagiscono, si distinguono reazioni di agglutinazione, precipitazione, lisi, complemento, neutralizzazione, ecc.

Gli IR sono divisi in semplici (due componenti, sono coinvolti solo AG e AT) e complessi (tre componenti e multicomponenti, sono coinvolti AG, AT e il sistema reagente: eritrociti sensibilizzati, coltura cellulare, pelle di un animale sensibile, ecc. ).

IMMUNOLOGICO
REAZIONI
DIPARTIMENTO DI MICROBIOLOGIA E VIRUSOLOGIA FSBEI
HE TSMU 2016

piano

PIANO
1. Test sierologici utilizzati
per la diagnostica sierologica.
2. Reazioni sierologiche utilizzate
per l’identificazione sierologica.
3.Metodi immunologici moderni
ricerca sulle malattie infettive:
(Immunoluminescente e immunoenzimatico
analisi, diagnostica genetica,
reazione a catena della polimerasi).
4. Reazioni sierologiche utilizzate in
virologia.

Tutte le reazioni sierologiche vengono utilizzate per un duplice scopo:

TUTTO SIEROLOGICO
REAZIONI UTILIZZATE
CON UN DUPLICE SCOPO:
per rilevare gli anticorpi nel siero del paziente
utilizzando antigeni diagnostici standard - per sierologico
diagnosi di malattie infettive;
per determinare antigeni sconosciuti
(batteri, funghi, virus) per noti
sieri anticorpali standard -
per l’identificazione sierologica
agenti patogeni.

classificazione

CLASSIFICAZIONE
Le reazioni immunitarie sono divise in semplici e
complesso. Per configurarli è necessario
i due componenti principali sono antigene e anticorpo.
Alle reazioni semplici utilizzate per
la diagnostica comprende reazioni di agglutinazione,
Reazioni di precipitazione, reazioni di neutralizzazione.
Per reazioni complesse: immunofluorescenza
metodo, metodo radioimmune,
metodo immunoenzimatico,
metodo di ricerca immunoluminescente,
metodo di immunoblotting.

Reazione di agglutinazione

REAZIONE
AGLUTINAZIONE
Reazione di agglutinazione (agglutinacio - incollaggio)
si manifesta esternamente con attaccamento e precipitazione
Antigeni corpuscolari: batteri, globuli rossi e
anche particelle con antigeni adsorbiti su di esse sotto
l'influenza degli anticorpi in un ambiente elettrolitico.
La reazione avviene in due fasi.
Nella prima fase avviene l'adsorbimento specifico
anticorpi sulla superficie di una cellula o di una particella che trasportano
antigeni corrispondenti,
Nel secondo - la formazione di un aggregato (agglutinato) e
la sua precipitazione e questo processo avviene
solo in presenza di un elettrolita (soluzione di cloruro
sodio).

Agglutinare

AGGLUTINARE
L'agglutinato può essere di due tipi: a grana fine e
cotone grande
Il risultato è a grana fine
interazioni di piccoli batteri,
cotone di grandi dimensioni – batteri,
avere flagelli.

Reazione di agglutinazione - tipi

REAZIONE
TIPI DI AGLUTINAZIONE
Tutte le reazioni di agglutinazione
si dividono in due tipologie:
indicativo (ORA), che
eseguito su vetro,
distribuito (RPA) – eseguito in
provette per la titolazione del siero.

La reazione di agglutinazione non è sufficientemente specifica e sensibile.

REAZIONE DI AGLUTINAZIONE
NON ABBASTANZA SPECIFICO E
SENSIBILE.
Aumentare specificità e sensibilità
le reazioni possono essere effettuate diluendo la sostanza in esame
siero al suo titolo o a metà titolo.
Il titolo del siero è il massimo
diluizione in cui si trova
agglutinazione dell'antigene.
Più alto è il titolo anticorpale, più affidabile
risultati della reazione.
Per differenziare la causa
reazione positiva (precedentemente trasferita
infezione, vaccinazione o malattia attuale),
valutare la dinamica dell'aumento del titolo
anticorpi, che si osserva solo con
infezione in corso...

Obiettivi fondamentali

OBIETTIVI FONDAMENTALI
Anche le reazioni indicative possono
hanno due obiettivi:
Identificazione delle specie microbiche (con
utilizzando un sistema immunitario noto
siero).
Cerca gli anticorpi nel siero del sangue
paziente che utilizza noto
diagnostico microbico.

10. Reazione di agglutinazione

REAZIONE
AGLUTINAZIONE

11. REAZIONI DI AGLUTINAZIONE ORIENTATIVA

ORA - reazione di agglutinazione indicativa

12. Schema della reazione di agglutinazione indicativa.

SCHEMA DI REAZIONE STIMATA
AGLUTINAZIONI.
Passaggi di esecuzione della reazione:
Applicare su vetro sgrassato
una goccia di soluzione salina.
Introdurre la cultura del test in un ciclo
batteri, distribuirli uniformemente
una goccia di soluzione salina
Aggiungi una goccia di specifico
immune agglutinante
siero
Considera il risultato della reazione.
Una reazione è considerata positiva
quando avviene la caduta
pulire il liquido e
formazione di agglutinati.

13. INTENSITÀ DELLA FORMAZIONE DI AGGLUTINATI

++++
Agglutinazione completa: sedimento molto grande, completa schiarimento
liquidi. Il risultato è positivo
+++
Agglutinazione incompleta: il sedimento è lo stesso, il surnatante è sopra
il sedimento è leggermente torbido. Il risultato è positivo
++
Debole
agglutinazione:
sedimento
piccolo,
liquido
opaco.
piccolo,
surnatante
Il risultato è debolmente positivo
+
Impronte
agglutinazione:
sedimento
opaco. Risultato della reazione discutibile
-
Reazione negativa: assenza di sedimento, la sospensione è uniformemente torbida.
liquido

14. modifiche Reazione di agglutinazione: queste sono la reazione di Minkevich e la reazione di Heddelson.

MODIFICHE DELLA REAZIONE DI AGLUTINAZIONE: QUESTA È UNA REAZIONE
LA REAZIONE DI MINKEVICH E HEDDELSON.
La reazione di Minkevich ci permette di determinare la presenza
anticorpi antitularemia in una persona infetta
paziente.
Ingredienti richiesti:
Una goccia di sangue del paziente prelevata utilizzando uno scarificatore
dal dito di un paziente
Acqua distillata
Tularemia diagnostica.

15. Fasi dell'esecuzione della reazione di Minkevich:

FASI DI ESECUZIONE DELLA REAZIONE DI MINKEVICH:
Mettere una goccia del sangue del paziente su un vetro sgrassato
Aggiungere una goccia di acqua distillata per lisare i globuli rossi
Aggiungere una goccia di tularemia diagnosticum
Considera i risultati.
La reazione è considerata positiva se si formano grani nella goccia
agglutinare.

16. AFFERMAZIONE DELLA REAZIONE DI HEDDLSON NELLA BRUCELLOSI

La reazione di Heddelson consente non solo di identificare
anticorpi nel siero di un paziente affetto da brucellosi,
ma anche per determinare il titolo anticorpale.
Ingredienti richiesti:
Siero del paziente
Salino
Diagnosi della brucellosi

17. Principio del metodo

PRINCIPIO DEL METODO
basato sull'utilizzo di una lastra fotografica in vetro di grandi dimensioni,
siero sanguigno concentrato non diluito del paziente
volumi in aumento o in diminuzione,
integrato ad un certo livello da elementi fisiologici
soluzione, che equivale a diverse diluizioni, e
colorato con blu di metilene diagnostico per meglio
visibilità dell'agglutinato risultante.
L'accelerazione della reazione si ottiene mescolando gli ingredienti
scuotendo leggermente il bicchiere e posizionandolo nel termostato a
+37Сº.
Analisi simultanea dei sieri da
diversi pazienti.
Il risultato si ottiene in 2-5 minuti sotto forma di agglutinato blu
attività diverse a seconda delle diluizioni.

18. La reazione di adsorbimento delle agglutinine secondo Castellani viene utilizzata per uno studio dettagliato della struttura antigenica dei batteri al fine di determinarne la ser

REAZIONE DI ADSORBIMENTO DELLE AGGLUTININE SECONDO CASTELLANI
UTILIZZATO PER LO STUDIO DETTAGLIATO DELL'ANTIGENICO
STRUTTURE DI BATTERI ALLO SCOPO DI DETERMINARE IL LORO SEROVAR
:
Questa reazione è basata sull'abilità
gruppi correlati di batteri vengono adsorbiti da
antisieri solo anticorpi del gruppo per
conservazione degli anticorpi specifici del tipo in esso.
Il siero risultante è chiamato monorecettore,
perché contengono anticorpi contro uno solo
un antigene specifico.
Se diversi batteri hanno lo stesso o
antigeni di gruppi simili che possono
agglutinato dallo stesso antisiero,
il che ne rende difficile l’identificazione.

19.

Principio del metodo:
Cross-RA ha lo scopo di estrarre gli anticorpi del gruppo
metodo di assorbimento
l'antigene specifico (AG) rimuove tutti gli anticorpi dal siero - e
specifico solo per lui e per il gruppo; ipertensione non specifica -
solo gruppo.
In questa reazione, usano un antigene specifico
correlati Ags eterologhi.
Ad esempio, in un paziente con febbre tifoide (T), il siero del sangue ha ceduto
agglutinazione con diagnostico specifico T e con gruppo
paratifo A.
Diagnostica con
antigeni
tifo
(AVSD)
Ricercato
siero con
anticorpi
(abcd)
2 ore +37C°,
18 – 20 ore
nel freddo
abcd
ABC
D
A
AG
2 ore +37 C°,
18 – 20 ore
nel freddo
ABCD
ABEF
ABCD
ABEF

20. Metodo espresso di reazione di agglutinazione al lattice (RAL) per la rilevazione di antigeni e anticorpi (versione indicativa)

REAZIONE DI AGLUTINAZIONE AL LATTICE (RAL)
METODO RAPIDO PER RILEVARE ANTIGENI E
ANTICORPO(VARIANTE ORIENTATIVA)
Per eseguire il RAL vengono utilizzate particelle sensibilizzate
lattice di polistirene con un diametro di 0,5-1,2 micron, che in
presenza di un reagente immunologico omologo (antigene
o anticorpi) restano uniti. Questa reazione accade abbastanza
rapidamente - per 2-7 minuti.
Le particelle di lattice caricate con anticorpi sono ampiamente
utilizzato per rilevare antigeni di virus e batteri.
Caricando il lattice con antigeni, è possibile determinare la presenza di anticorpi
siero del paziente.
Questa modifica del RAL viene utilizzata per identificare
anti-influenza, anti-rosolia,
anticorpi anti-morbillo, ecc.

21. Esecuzione della reazione di aglutinazione del lattice

EFFETTUARE LA REAZIONE
AGLUTINAZIONE DEL LATTICE

22. Reazione di coagglutinazione (COA).

REAZIONE
COAGGLUTINAZIONE (COA) .
Per stadiare il COA viene utilizzato lo Staphylococcus aureus (ceppo
Cowan 1). La parete cellulare di questi microrganismi contiene
proteina A, che ha un'affinità significativa con il frammento Fc delle IgG
uomo e coniglio. Pertanto, le molecole IgG dopo l'adsorbimento si attivano
stafilococchi, che hanno la proteina A orientata
ambiente con i loro frammenti Fab gratuiti, in cui
Si trova il centro attivo dell'anticorpo.

23. Reazione di coagglutinazione (COA).

REAZIONE
COAGGLUTINAZIONE (COA) .
La reazione viene condotta su lastre di vetro, mescolando
volumi uguali (1-2 gocce) della sostanza in esame
materiale (sangue, urina, saliva, filtrati fecali e
ecc.) e diagnosticum stafilococcico.
La miscela viene accuratamente miscelata e dopo 2-5 minuti. SU
su uno sfondo scuro dovrebbe essere chiaramente visibile
agglutinazione a grana fine degli stafilococchi.

24. La REAZIONE DI EMAGGLUTINAZIONE INDIRETTA (PASSIVA) è la reazione sierologica più sensibile

REAZIONE INDIRETTA (PASSIVA).
LE EMAGGLUTINAZIONI SONO LE PIÙ IMPORTANTI
REAZIONI SIEROLOGICHE SENSIBILI
Basato sulla capacità degli anticorpi di interagire
antigene fissato su vari
eritrociti, che poi agglutinano.
Per eseguire questa reazione è necessario prepararsi
diagnostico eritrocitario.
Il diagnostico eritrocitario può essere di due tipi:
antigene e anticorpo.

25. Fasi dell'esecuzione di una reazione:

FASI DELLA REAZIONE:
Ingredienti richiesti:
Siero sanguigno
infetto
paziente
Aggiungere la soluzione fisiologica nei pozzetti della compressa.
soluzione nella stessa quantità -0,25 ml
per diluire il siero di latte
Aggiungere il siero del sangue al primo pozzetto
paziente, diluito 50 volte in volume
0,25ml; mescolare il contenuto con una pipetta
e con la stessa pipetta prelevare 0,25 ml e
passare alla buca successiva
Mescolare il contenuto e ripetere l'operazione
procedura in tutti i pozzetti previsti
per effettuare la reazione.
Preparare il controllo, perché in uno
aggiungere nel pozzetto 0,25 ml di soluzione fisiologica
soluzione
In tutti i pozzi, compreso quello di controllo,
aggiungere 2 gocce del preparato
diagnostico eritrocitario e
mescolare delicatamente
dondolando il tablet.
Salino
Eritrociti
diagnosticum
Reazione passiva
emoagglutinazione
eseguita nei buchi
immunologico
tavoletta.

26. REAZIONE DI EMAGGLUTINAZIONE INDIRETTA (PASSIVA).

Un test è considerato positivo quando c'è
il giorno del controllo, i globuli rossi si trovano sotto forma di un "pulsante" e in
Nei fori sperimentali il sedimento appare sotto forma di un “ombrello”.
Schema per l'impostazione e la registrazione di RPGA

27. Criteri per prendere in considerazione i risultati delle reazioni

CRITERI PER I RISULTATI DELLE REAZIONI CONTABILI
++++
Agglutinazione completa: il sedimento occupa l'intero fondo del pozzetto. Risultato
positivo
+++
Agglutinazione incompleta: il sedimento occupa tre quarti del fondo
buchi. Il risultato è positivo
++
Agglutinazione debole: il sedimento occupa meno della metà del fondo
buchi. Il risultato è discutibile
+
Tracce di agglutinazione: piccolo sedimento. Dubbioso
risultato della reazione
-
Reazione negativa: il sedimento occupa la centrale
posizione con bordi arrotondati.

28. REAZIONI DI AGLUTINAZIONE SVILUPPATE.

.
REAZIONI DI AGLUTINAZIONE SVILUPPATE
Vengono proposte reazioni di agglutinazione dettagliate
alla ricerca di anticorpi nei sieri sanguigni delle persone infette
pazienti con determinate infezioni batteriche.
In questo caso viene utilizzata la diagnostica
preparato da microrganismi.
Per eseguire queste reazioni è necessario
titolazione preliminare del siero.

29. Per eseguire queste reazioni è necessaria la titolazione preliminare del siero.

PER ESEGUIRE QUESTE REAZIONI SERVE
TITOLAZIONE PRELIMINARE DEL SIERO.
Una diluizione di 1:10 corrisponde a 1 ml di siero + 9 ml di soluzione salina. soluzione
1:50 è 1 ml di siero + 49 ml di soluzione salina. soluzione o
1:50 corrisponde a 0,1 ml di siero + 4,9 ml di soluzione salina. soluzione
1:100 corrisponde a 1 ml di siero + 99 ml di soluzione salina. soluzione o
1:100 corrisponde a 0,1 ml di siero + 9,9 ml di soluzione salina. soluzione.
Aggiungere 2,5 ml di soluzione fisiologica in 10 provette.
8 provette saranno sperimentali, 2 - controllo: controllo
controllo del siero e dell'antigene.
Nel siero di controllo aggiungiamo solo diluito
siero in un volume di 2,5 ml, solo per il controllo dell'antigene
sospensione diagnostica.

30. Contabilità della reazione

CONTABILITÀ DELLE REAZIONI
Aggiungere quindi 1 ml di sospensione in tutte le provette, ad eccezione del siero di controllo.
diagnosticum.
Come risultato della formazione di liquido agglutinato e torbido nelle provette
schiarisce, sul fondo si deposita un precipitato di agglutinato.
La contabilizzazione della reazione inizia con i campioni di controllo: nel controllo del siero
dovrebbe esserci un siero limpido, nel controllo dell'antigene - in modo uniforme
sospensione torbida del diagnosticum.
Il titolo PPA viene preso in considerazione in base alla diluizione del siero, in cui si trova ancora chiaramente
è visibile la formazione di un precipitato agglutinato.

31. SCHEMA PER AVVIARE UNA REAZIONE DI AGLUTINAZIONE SVILUPPATA CON SIERO PAZIENTE SECONDO VIDAL (WRIGHT)

ingredienti
Contenuto dei tubi
Fisiologico
soluzione
0,85
Controllo
Sieri
Antigena
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,5
a 0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
--
%
cloruro di sodio, ml
Siero
diluizione 1:50ml
Allevamenti
diagnostico,
miliardi
(1: 50)
1: 100
1-2 2k
1: 200
1: 400
1: 800
-
2k
2k
2k
-
microbica In termostato a +37C° per 2 ore, poi per 18-20 ore a
corpi in 1 ml.
temperatura ambiente
2k

32. La reazione di precipitazione differisce dall'agglutinazione nella natura degli antigeni:

LA REAZIONE DELLA PRECIPITAZIONE È DIVERSA DA
AGGLUTINAZIONE PER NATURA DEGLI ANTIGENI:
Nella reazione di agglutinazione sono addirittura corpuscolari
cellule intere, e nella reazione di precipitazione -
molecolare, in uno stato solubile.
Gli antigeni possono essere estratti
microrganismi, tessuti, organi, sostanze chimiche
sostanze.
Il fenomeno delle precipitazioni è questo
anticorpi (precipitine), combinandosi con
antigeni solubili (precipitinogeni),
predeterminare la formazione del sedimento (precipitato)
o torbidità della soluzione.
Come titolo della reazione viene presa la diluizione più alta.
antigene, che dà un risultato positivo.

33. Il fenomeno della precipitazione è ampiamente utilizzato nella pratica microbiologica:

IL FENOMENO DELLE PRECIPITAZIONI IN MODO AMPIO
UTILIZZATO IN MICROBIOLOGICO
PRATICA:
Nella visita medica forense viene utilizzato per determinare
gruppo sanguigno: è possibile determinare quale tipo
appartiene al sangue identificato.
Determinare la possibile falsificazione dei prodotti (carne, miele). Per
diagnosi di meningite cerebrospinale epidemica, peste,
dissenteria, determinando l'infezione con l'agente patogeno siberiano
ulcere di prodotti e materiali di origine animale (pelle, pelliccia,
setola).
Per determinare viene utilizzata la reazione di Uchterlony
composizione antigenica di organi e tessuti come normale,
e tumore, il numero di antigeni nel complesso
sistemi.
È importante nella diagnosi della difterite, del vaiolo e altro
malattie.

34. . Rilevazione di AG nella reazione di precipitazione dell'anello.

. RILEVAMENTO AG NELLA REAZIONE
PRECIPITAZIONE DELL'ANELLO.

35. Reazione di microprecipitazione usando l'esempio della diagnosi rapida della sifilide (EDS).

REAZIONE DI MICROPRECIPITAZIONE SULL'ESEMPIO DI DIAGNOSI ESPRESSA DI SIFILIDE (EDS).
Questa reazione viene eseguita per lo screening dei sieri in massa
esami per la sifilide
I sieri del sangue dei pazienti vengono utilizzati come anticorpi.
L'antigene è l'antigene della cardiolipina (non specifico).
La reazione viene eseguita nei pozzetti di una piastra immunologica.
È necessario avere due controlli: nel primo come ingredienti
vengono utilizzati soluzione salina e antigene cardiolipina
(controllo della torbidità), nel secondo controllo - ovviamente positivo
siero e antigene cardiolipina (controllo del precipitato).
Nel pozzetto sperimentale è presente il siero del paziente in studio, prelevato in diluizione
1:10 e antigene cardiolipina.
Dopo aver miscelato i reagenti, agitare delicatamente per 2-5 minuti
compressa, durante questo periodo si forma un precipitato liquido
il foro diventa trasparente.
La reazione viene registrata utilizzando il sistema quattro-più. Risultato,
valutato come uno e due più è considerato dubbio, 3 e 4
++++ - positivo. Schema di reazione di microprecipitazione
mostrato in Fig. 10.

36. Diagnosi espressa di sifilide (EDS).

DIAGNOSTICA ESPRESSA
SIFILIDE (EDS).

37. Metodo per determinare la quantità di immunoglobuline nel siero del sangue (reazione di Mancini)

METODO PER DETERMINARE LA QUANTITÀ
IMMUNOGLOBULINE
NEL SIERO DEL SANGUE (REAZIONE DI MANCINI)
Il semplice metodo di immunodiffusione lineare si basa sull'interazione
antisiero contenuto in un gel di agar-agar con una soluzione antigenica
formano linee e strisce di precipitazione.
A giudicare dall'ampiezza delle zone di precipitazione nel semplice test radiale
diffusione, è possibile effettuare la determinazione quantitativa
antigeni.
La posizione relativa delle linee di precipitazione nel doppio e
la contro immunodiffusione consente di valutare
somiglianza immunochimica o differenza antigenica
componenti.
I metodi di immunodiffusione sono caratterizzati da un livello elevato
specificità e sensibilità.
I test di immunodiffusione sono comunemente usati per identificare
proteine ​​nei fluidi biologici come il siero del sangue,
liquido cerebrospinale, secrezioni o estratti ghiandolari
vari organi, ecc.

38. Immunoelettroforesi

IMMUNOELETTROFORESI
Il metodo combina una reazione di precipitazione del gel con
elettroforesi.
Per fare questo, uno strato di agar viene applicato su un vetrino,
due fori sono ritagliati su bordi diversi e al centro c'è un foro di separazione
scanalatura.
Una miscela di antigeni viene aggiunta ai pozzetti e viene effettuata l'elettroforesi
entro 1-2 ore.
Diversi antigeni si muovono a velocità diverse tra loro
catodo e anodo.
Quindi il siero precipitante viene introdotto nella scanalatura e attraverso
Dopo 5-7 giorni nel gel si formano zone di precipitazione.
Per una migliore visualizzazione, l'agar viene colorato con coloranti.
(ad esempio, nero amido).

39. Schema di immunoelettroforesi.

SCHEMA PER IMMUNOELETTROFORESI.

40. Immunoelettroforesi

IMMUNOELETTROFORESI
archi di precipitazione.

41. Reazione di batteriolisi

REAZIONE DI BATTERIOLISI
usato raramente, è usato per
diagnosi differenziale di Vibrio cholerae da
altri batteri simili al colera.
La reazione si basa sulla capacità di anticorpi specifici
formare complessi immunitari con cellule, incluso
con batteri
che porta all’attivazione del sistema del complemento
via classica e lisi batterica.

42. Nella reazione di emolisi

NELLA REAZIONE DELL'EMOLISI
i globuli rossi fungono da antigeni e gli eritrociti fungono da anticorpi.
anticorpi antiemolitici.
Quando si forma un complesso antigene-anticorpo,
attivazione del complemento, con conseguente sospensione torbida
i globuli rossi si trasformano in rosso vivo trasparente
liquido – sangue “verniciato” a causa del rilascio
emoglobina.
Quando si imposta una reazione di legame diagnostico
la reazione di emolisi del complemento (CSC) viene utilizzata come
indicatore: per testare la presenza o
assenza (vincolante) del complemento libero.

43. Reazione di lisi e fissazione del complemento.

REAZIONE DI LISI E LEGAME
COMPLEMENTO.
Antigene, anticorpo e complemento necessari.
L'antigene può essere microrganismi, globuli rossi o
altre cellule.
Come viene utilizzato un anticorpo (lisina) per utilizzare un siero specifico
o il siero del paziente.
A seconda delle cellule contro cui è diretto
azione della lisina, hanno i loro nomi:
contro batteri - batteriolisine, spirochete spirochetolisine, eritrociti - emolisine, contro altri
cellule - citolisina.
Il complemento, quando forma un complesso anticorpo cellulare (antigene), si lega ad esso e si attiva seguendo il classico
modo e provoca la dissoluzione delle cellule.
Senza complemento, la lisi cellulare è impossibile. Distinguere
diverse reazioni di lisi: batteriolisi, emolisi, citolisi.

44. Reazione di fissazione del complemento (CFR).

REAZIONE LEGANTE
COMPLEMENTO (RSK).
Quando si forma un complesso antigene-anticorpo, lo è sempre
viene aggiunto il complemento.
Se l'antigene e l'anticorpo non rispondono tra loro, allora
il complemento non è vincolato e rimane libero nel sistema.
Quando si aggiunge un complesso di eritrociti di pecora - emolisina
il complemento libero, legandosi ad esso, provoca l'emolisi
globuli rossi
Questo principio costituisce la base dell'RSK.
Quando l'antigene corrisponde all'anticorpo, si lega ad esso
complemento. Per verificarlo, aggiungere globuli rossi
siero di pecora e siero emolitico.
In assenza di emolisi, si conclude che la reazione
positivo; in presenza di emolisi la reazione è negativa.

45. Reazione di fissazione del complemento (CFR).

REAZIONE LEGANTE
COMPLEMENTO (RSK).
Sistema sperimentale
ANTIGENE
(Batteri, cellule, virus e
eccetera.)
COMPLEMENTO
ANTICORPO
(siero) Complemento
contattato il complesso
antigene-anticorpo
Emolitico indicativo
Sistema del cielo
eritrociti
RRAM (ANTIGENE)
EMOLITICO
SIERO (ANTICORPO)
Nessun complemento: contattato
con un sistema sperimentale.
Senza emolisi del complemento
globuli rossi
impossibile.

46. ​​Reazione di fissazione del complemento (CFR).

REAZIONE LEGANTE
COMPLEMENTO (RSK).

47. Criteri per prendere in considerazione i risultati delle reazioni

++++
Pieno
ritardo
emolisi,
globuli rossi
V
bozza,
il liquido surnatante è limpido; fortemente positivo
RSK.
+++
Incompleto
ritardo
emolisi,
globuli rossi
V
bozza,
il liquido surnatante è trasparente, di colore leggermente rosato;
RSC positivo.
++
Ritardo emolisi parziale, surnatante
rosso-rosa, trasparente; debolmente positivo
RSK.
+
Il sedimento è lieve, il liquido è rosso; dubbioso
RSK.
-
Emolisi completa, liquido rosso limpido. Negativo
RSK.

48. (RSK)

49. Determinazione degli anticorpi anti-Rhesus nel siero.

DETERMINAZIONE DEGLI ANTICORPI ANTI-RHESUS NEL SIERO.
Questa reazione viene effettuata nelle donne in gravidanza,
avere un fattore Rh negativo.
Se il padre del bambino ha un fattore Rh positivo,
quindi il feto può avere sia positivo che
Rh negativo.
Per prevenire il conflitto Rh, devi sapere
Durante la gravidanza si formano gli anticorpi anti-Rh?
e se si formano, prosegue la dinamica della loro crescita?
titolo.

50. Per eseguire questa reazione sono necessari i seguenti ingredienti

PER INIZIARE QUESTA REAZIONE
SEGUENTI INGREDIENTI RICHIESTI
Prova il siero
Globuli rossi umani che trasportano un fattore Rh positivo
(globuli rossi standard)
Complemento.
Fasi di impostazione del test:
Aggiungere 1 ml di siero di prova in una provetta.
In ogni provetta aggiungiamo una sospensione del 2% di standard
globuli rossi
Aggiungiamo la stessa quantità di complemento in una dose di lavoro.
Usiamo il siero come controllo positivo,
avere anticorpi anti-Rhesus; come negativo
controllo: siero ovviamente negativo.

51. I risultati vengono registrati per l'emolisi:

IL RISULTATO È RACCONTATO DELL'EMOLISI:
In una provetta di controllo negativo
osserviamo un sedimento di eritrociti
- In una provetta di controllo positivo
– emolisi completa, cioè
uniformemente colorato di rosso
liquido
- Nei campioni in studio, se disponibili
anticorpi anti-Rhesus – emolisi completa, con
la loro assenza – sedimento eritrocitario.

52. REAZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE DEL VIRUS

La reazione è ampiamente utilizzata in virologia per
determinazione del tipo (tipo) dell'agente patogeno e del titolo
anticorpi neutralizzanti il ​​virus.
Questi anticorpi vengono solitamente rilevati quando
mescolando il siero immunitario con il virus appropriato e poi iniettandolo
miscele ad animali da laboratorio sensibili
o infezione della coltura cellulare.
Basato sulla sopravvivenza dell'animale nel primo
caso o assenza di effetto citopatico
il virus nel secondo è giudicato neutralizzante
attività del siero.

53. Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI)

RISPOSTA IN FRENATA
EMAGGLUTINAZIONE (HMA)
In base alla proprietà
gli antisieri sopprimono il virus
emoagglutinazione, poiché neutralizzata
il virus perde anticorpi specifici
capacità di agglutinare i globuli rossi.
RTGA è ampiamente utilizzato per la sierodiagnosi
infezioni virali da rilevare
antiemoagglutinine specifiche
e per identificare molti virus in base ai loro
emoagglutinine (antigeni).

54. REAZIONI CHE COINVOLGONO ANTIGENI O ANTICORPI MARCATI

Sono coinvolti antigeni o anticorpi marcati.
Questi includono le reazioni
immunofluorescenza,
radioimmune
metodi di dosaggio immunoenzimatico.
In termini di sensibilità sono superiori
tutto descritto sopra
reazioni sierologiche.

55. Reazioni di immunofluorescenza (secondo Koons) metodo diagnostico rapido,

REAZIONI DI IMMUNOFLUORESCENZA (BY
KUNSU) METODO DIAGNOSTICO ESPRESSO,
Per rilevare antigeni microbici in
tessuti utilizzati etichettati
siero diagnostico contenente
anticorpi contro alcuni tipi (varianti) di microrganismi (batteri,
virus).
Viene prodotta la marcatura degli anticorpi
fluorocromi (isotiocianato
fluoresceina)

56. METODO DI ANALISI IMMUNOENZIMATICA - ELISA

include l'uso di reagenti commerciali - antigeni
o anticorpi marcati con enzimi (ad esempio,
perossidasi o fosfatasi alcalina).
Il metodo viene eseguito in lastre di polistirolo, dove nei pozzetti
l'antigene o l'anticorpo è fissato.
Dopo la formazione del complesso immunitario, viene introdotto il sistema
substrato che viene scomposto da un enzima, risultando
colorare l'ambiente.
A differenza dei metodi di rilevamento classici, ELISA consente
registrare direttamente l'interazione dell'antigene con
anticorpo in una fase specifica,
piuttosto che analizzare le manifestazioni secondarie dell'interazione -
agglutinazione, precipitazione o emolisi.
Il metodo si distingue per l'elevata sensibilità, di solito
è sufficiente la presenza dell'antigene alla concentrazione di 1 ng ml.

57. METODO DI ANALISI IMMUNOENZIMATICA - ELISA

58. Fasi dell'esecuzione di una reazione (usando l'esempio della diagnosi degli anticorpi per l'infezione da HIV):

FASI DI ESECUZIONE DELLA REAZIONE (PER ESEMPIO
DIAGNOSI DEGLI ANTICORPI PER L'INFEZIONE DA HIV):
Nei pozzetti di una piastra di polistirolo su cui viene assorbito l'antigene
HIV, viene aggiunto il siero del sangue dei pazienti. La prima buca è prevista
per aver introdotto il siero ovviamente positivo, il secondo - ovviamente
negativo
Incubare la piastra in una camera umida per 30 minuti
Lavare i pozzetti della piastra con soluzione salina tamponata con fosfato 5 volte
Aggiungere l'antisiero contenente anticorpi contro
immunoglobuline umane marcate con enzimi
Lavare i pozzetti con soluzione salina tamponata con fosfato 5 volte
Aggiungere un substrato contenente perossido di idrogeno e
benzidina
Conservare la compressa in un luogo buio per 20 minuti
Effettuiamo una registrazione visiva dei risultati e determiniamo l'ottica
densità della soluzione in ciascun pozzetto utilizzando il dispositivo

59. METODO DI ANALISI IMMUNOENZIMATICA - ELISA

Se l'analisi viene eseguita correttamente in un pozzetto contenente
siero di controllo positivo, cambiamenti di colore - it
diventa giallo.
Nel controllo negativo il colore è trasparente.
La presa in considerazione dei risultati dei prototipi dipende dal cambiamento
colore nel test bene - se cambia, come in
controllo positivo, il che significa che in questo paziente
sono stati rilevati anticorpi contro l'HIV.

60. semplificare l'utilizzo dei sistemi ELISA “reagent-free”.

UTILIZZO PIÙ FACILE
SISTEMI ELISA “REAGENT-FREE”.
Per effettuare l'analisi è sufficiente applicarla al corriere.
campionare e osservare visivamente il cambiamento di colore del supporto,
che si verifica a seguito della formazione di un prodotto enzimatico
reazioni.
Vantaggi:
non vengono utilizzati isotopi radioattivi,
la stabilità dei coniugati ne consente la conservazione
per molto tempo,
la misurazione della densità ottica viene eseguita nel campo ottico,
I risultati ELISA possono essere valutati in modo semiquantitativo senza
uso dell'attrezzatura (visivamente).
ELISA è molto facile da automatizzare.

61. Test radioimmunologico (RIA)

RADIOIMMUNOLOGICO
ANALISI (RIA)
Il vantaggio della RIA: non è necessario valutare
reazione in corso a manifestazioni secondarie, come
agglutinazione, precipitazione, lisi dei globuli rossi.
2 opzioni:
antigeni marcati e non marcati competono per un numero limitato
numero di siti di legame con anticorpi specifici.
Affinché possa verificarsi un’interazione competitiva,
ci deve essere un certo grado di relazione tra
antigene marcato e non marcato.
Dopo due fasi di incubazione degli anticorpi, prima con il soggetto del test e
quindi con antigene marcato standard
quantità inclusa negli immunocomplessi
l'antigene marcato sarà inversamente proporzionale alla quantità
antigene non marcato nel campione da testare.

62. Fonti di informazione:

FONTI DI INFORMAZIONE:
Fondamentale A.
Korotyaev A.I., Babichev S.A. Microbiologia medica,
immunologia e virologia. -S-P., 2000.
Microbiologia medica./ Ed. IN E. Pokrovsky.M.,
2001.
L.B.Borisov.Medical
microbiologia, virologia, immunologia. M., 2001
Microbiologia medica, virologia /Under
ed. A. A. Vorobyova, M. 2004.

Le reazioni immunitarie si basano sull'interazione specifica di un antigene con un anticorpo. Utilizzando antigeni noti è possibile determinare la presenza di anticorpi nel siero del paziente o della persona esaminata (diagnosi sierologica delle malattie infettive). E, al contrario, la presenza di sieri immunitari specifici consente di stabilire il generico, la specie e il tipo di microrganismo (identificazione sierologica del microbo mediante struttura antigenica).

L'agglutinazione è l'incollaggio di microbi o altre cellule quando esposti al siero immunitario contenente anticorpi - agglutinine. La reazione di agglutinazione si manifesta nel fatto che una sospensione uniforme di cellule, ad esempio batteri, quando si aggiunge siero immunitario, le cellule si torcono, formano granuli o scaglie, che gradualmente si depositano sul fondo, mentre il liquido sopra il sedimento diventa completamente limpido. Tuttavia, granuli o scaglie si formano solo se la reazione avviene in presenza di elettroliti. Pertanto, affinché avvenga una reazione di agglutinazione, è necessario disporre di: 1) un antigene (agglutinogeno) sotto forma di sospensione cellulare; 2) anticorpi (agglutinine) sotto forma di siero immunitario; 3) elettroliti (soluzione salina).

La manifestazione esterna di una reazione di agglutinazione batterica positiva ha un duplice carattere, a seconda delle proprietà dell'antigene: nei batteri flagellati, che hanno un solo antigene somatico o O, le cellule microbiche stesse si uniscono e le emorroidi risultanti hanno l'aspetto di grani piccoli e compatti. Questa agglutinazione è detta a grana fine; avviene lentamente - nell'arco di 18-22 ore. I batteri dotati di flagelli hanno due antigeni: uno somatico, l'antigene O, nella cellula stessa e un flagellare, l'antigene H, situato nel flagello. Le cellule si uniscono ai flagelli e formano grandi scaglie sciolte. Questo tipo di agglutinazione è chiamata agglutinazione grossolana; arriva rapidamente - entro 2-4 ore.

La reazione di agglutazione, per la sua specificità, semplicità, stadiazione e dimostratività, si è diffusa nella pratica microbiologica per la diagnosi di molte malattie infettive: febbre tifoide, tifo, febbre paratifoide, dissenteria, colera, brucellosi, ecc. Viene utilizzata per la diagnosi scopi in 2 direzioni.

1. Determinare l'isolamento di un microbo sconosciuto isolato da qualsiasi substrato. In questo caso l'agglutinazione viene eseguita con un siero agglutinante specifico e già preparato, ottenuto immunizzando conigli con un certo tipo di batteri e, quindi, contenente agglutinine contro questi batteri.

Una coltura di un microbo sconosciuto in fase di studio viene presa come antigene. Un risultato di reazione positivo indica che il microbo sconosciuto è identico a quello preso come antigene per la preparazione del siero agglutinante.

2. Per rilevare le agglutinine verso uno o un altro tipo specifico di batteri nel siero del paziente. In questo caso, per l'agglutinazione, una certa coltura di batteri in laboratorio (o più colture di batteri di specie diverse) viene presa come antigene e il siero del paziente. Un risultato di agglutinazione positivo indica che il siero del paziente contiene agglutinine di un tipo specifico e noto di microbo, ad es. questo microbo è l'agente eziologico della malattia, durante la quale gli anticorpi protettivi si accumulano nel siero del paziente.

Meccanismo: “teoria del reticolo”.

Il centro attivo dell'AT si collega con il 1° determinante antigenico, il 2° centro attivo reagisce con il determinante antigenico situato sulla 2a molecola antigenica, provocando l'incollaggio. Se un batterio flagellato viene considerato AT, la granularità è fine - agglutinazione; se flagellato - agglutinazione H (granularità grossolana).

Opzioni di agglutinazione:

1. Approssimativo sul vetro: per identificare le proprietà sierologiche dei batteri, per identificare i segni, per l'identificazione.

2. Utilizzato in provette: bassa sensibilità e bassa specificità. Viene determinato il titolo AT (questa è la diluizione massima del siero in cui è stata rilevata l'agglutinazione).

3. RNGA (reazione allo stress) - una reazione di agglutinazione genetica continua - viene utilizzata l'AG assorbito sugli eritrociti di pecora, ad es. trasferimento da solubile a corpuscolare - agglutinazione dei globuli rossi.

Il siero diagnostico agglutinante viene preparato immunizzando i conigli.

Il siero di un paziente per la stadiazione di una reazione di agglutinazione viene ottenuto dal suo sangue, prelevato sterilimente dalla vena cubitale in una quantità di 5-10 ml. Allo stesso tempo, parte del sangue viene utilizzata per la coltura. Se il sangue è necessario solo per mettere in scena una reazione, 1-2 ml sono sufficienti. Quindi prelevano il sangue dal dito pungendolo con un ago di Frank.

AG per la reazione di agglutinazione sono le corrispondenti colture batteriche vive o uccise. Le colture vive vengono utilizzate quando viene eseguita l'agglutinazione per determinare il tipo di batteri isolati da qualsiasi substrato.

I diagnosticum sono preparati diagnostici contenenti antigeni e utilizzati per rilevare gli antigeni.

24 Reazione delle precipitazioni e suo significato, portata. Metodi di stadiazione. Sieri precipitanti, loro preparazione e titolazione. Utilizzo della reazione di precipitazione nella diagnosi delle infezioni.

Le reazioni di precipitazione si basano sul fenomeno della formazione di un sedimento visibile (precipitato) dopo l'interazione dell'AG solubile o colloidale disperso con l'AT. RP consente di rilevare piccole quantità di AG. Sono molto sensibili e vengono utilizzati per analisi immunochimiche fini che identificano i singoli componenti in una miscela con antigeni. Il metodo ha molte varietà.

La reazione della colcecipitazione. Sullo strato di antisiero viene stratificato un liquido contenente AG e dopo pochi secondi si osserva la formazione di un anello di precipitato.

Le reazioni di microprecipitazione vengono utilizzate per il rilevamento nefelometrico dell'AT in piccoli campioni di siero.

Precipitazione in gel - su agar, viene utilizzata per determinare la tossigenicità dei batteri isolati. Per la difterite, tossicosi da stafilococco, per determinare l'immunoglobulina cellulare nel siero del sangue.

La reazione di precipitazione è caratterizzata da elevata sensibilità e specificità. Permette di rilevare le più piccole tracce di proteina-antigene (fino ad una diluizione di 1:100.000 e oltre), per cui la precipitazione è praticamente diventata una reazione importante in chimica, biologia, ecc.

La reazione di precipitazione è estremamente importante nella pratica forense per riconoscere il tipo di sangue non solo allo stato fresco e liquido, ma anche allo stato essiccato, ad esempio nelle macchie di origine molto antica sui vestiti.

Nella pratica sanitaria, la reazione di precipitazione è un metodo per determinare la falsificazione di carne, farina e altri preparati.

Per la diagnosi sierologica, la reazione di precipitazione viene utilizzata nei casi in cui l'antigene può essere ottenuto solo allo stato liquido, ad esempio in un estratto di organi infetti, nel liquido cerebrospinale, nell'urina del paziente, ecc.

Le reazioni di precipitazione possono essere effettuate sia con sostanze di natura proteica - antigeni a tutti gli effetti, sia con apteni - antigeni difettosi, che da soli non possono causare la formazione di antigeni, ma possono combinarsi con essi.

Impostazione di una reazione. Per eseguire la reazione di precipitazione è necessario avere:

1. siero precipitante preparato immunizzando conigli con l'antigene appropriato;

2. l'AG test sotto forma di soluzione trasparente centrifugata o filtrata (estratto dei loro corpi microbici, substrati patologici del paziente, organi, macchie di sangue, proteine ​​sieriche, ecc.). Prima di impostare la reazione, l'AG viene diluito con soluzione fisiologica almeno 1:1000 ;

3. soluzione fisiologica (per diluire siero e antigene);

4. provette speciali strette (non più larghe di 0,75 cm) con fondo conico e vetro molto trasparente;

5. Pipette Pasteur;

Un prerequisito è la completa trasparenza degli ingredienti coinvolti nella reazione di agglutinazione: siero e AG. Altrimenti, i risultati della reazione non saranno chiari.

In una provetta si versano 0,2 ml di siero precipitante; quindi, utilizzando una pipetta Pasteur, stratificare con attenzione 0,2 ml di AG sul siero (il liquido viene abbassato lungo la parete della provetta in modo che non si mescoli con il siero, ma formi uno strato superiore sopra di esso). Aggiungendo AG. La provetta viene posizionata su un supporto. Se il risultato della reazione è positivo, immediatamente o entro 5-10 minuti si forma un anello torbido di AG precipitato sul confine di entrambi i liquidi. Il grado di reazione è valutato dalla dimensione dell'anello e dal tempo della sua manifestazione.

All'esperimento vengono aggiunti diversi controlli, vale a dire: 1) antigeni noti + siero precipitante specifico; 2) siero precipitante + soluzione salina; 3) siero normale + test ipertensione.

25 La reazione di lisi immunitaria è uno dei meccanismi dell'immunità. Componenti della reazione, uso pratico.

Una delle proprietà protettive del siero immunitario durante l'infezione è la sua capacità di dissolvere (lisare) m/o altri elementi cellulari che entrano nel corpo. Gli anticorpi specifici che causano la lisi cellulare (dissoluzione) sono chiamati lisine. A seconda dell'AG, sono più precisamente chiamate batteriolisine, spirochetolisine, citolisine, ecc.

Le lisine sono in grado di esercitare il loro effetto lisante sull’ipertensione solo in presenza di un fattore aggiuntivo: il complemento. Il complemento è un componente di qualsiasi siero fresco, sia normale che immune. Quando il siero viene immagazzinato o riscaldato, il complemento viene distrutto.

Quello. la reazione di lisi avviene con la partecipazione di due componenti: uno specifico, contenuto nel siero immunitario (AT), e l'altro non specifico, inerente a qualsiasi siero, sia immunitario che normale (complemento).

Il siero immunitario appena estratto dal corpo è capace di lisi, poiché contiene sia AT che complemento. Se usano siero immunitario che è rimasto fermo o riscaldato e, di conseguenza, ha perso il complemento, la lisi avverrà solo se viene aggiunto il complemento, ad es. siero di latte fresco. Per garantire la coerenza dei risultati, il siero immunitario viene inattivato preventivamente riscaldandolo a 56 gradi per 30 minuti (per distruggere il complemento in esso presente) e ad esso viene aggiunta una quantità rigorosamente definita di complemento. È consuetudine utilizzare come complemento il siero fresco di una normale cavia.

Quando si differenziano i vibrioni del colera e quelli simili al colera.

26. Reazione di fissazione del complemento nella diagnosi delle malattie infettive. Applicazione pratica, componenti della reazione.

Questa reazione viene utilizzata per la sierodiagnosi e il rilevamento degli antigeni nel materiale del test e per la sieroidentificazione delle colture isolate. È caratterizzato da un'elevata sensibilità e sufficiente specificità, nonché dalla possibilità di utilizzare sia G corpuscolare che solubile. Quest'ultimo è dovuto al fatto che il complemento si lega al frammento Fc dell'AT, indipendentemente dalla loro specificità. Pertanto, la capacità del complemento di legarsi solo al complesso AG-AT grazie ai frammenti Fc di quest'ultimo e di non causare emolisi degli eritrociti sensibilizzati (sistema di test) è servita come base per l'uso diffuso di RSC nella pratica di laboratorio nel corso degli anni. secolo scorso.

Per stadiare la RSC è necessaria una preparazione preliminare degli ingredienti di reazione, in particolare del complemento, che viene utilizzato come siero di cavia con l'impostazione della dose di lavoro. Tuttavia, negli ultimi decenni, è stato prodotto il complemento titolato secco, che ha notevolmente facilitato la messa in scena della reazione. Il siero sanguigno e gli antigeni da testare devono essere monitorati per accertarne l'anticomplementarità.

L'esperimento principale viene eseguito in provette aggiungendo determinati volumi di siero sanguigno, antigene e una dose di lavoro di complemento. La miscela viene incubata in un termostato a 37 gradi per un'ora. La registrazione dei risultati della reazione viene effettuata mediante emolisi degli eritrociti di pecora sensibilizzati. Vengono preparati mescolando siero emolitico di coniglio con globuli rossi di pecora. Quando si aggiunge il complemento a questa miscela, si verifica una reazione di emolisi. Pertanto, nei casi in cui il complemento non si lega al sistema AG-AT in studio, ad es. rimane libero, si osserva un'emolisi completa dei globuli rossi di pecora, che indica una reazione negativa. L'assenza di emolisi indica il legame del complemento da parte del sistema AG-AT, cioè una reazione positiva, indicata dalle croci. L'intensità dell'emolisi ritardata viene valutata utilizzando un sistema quadruplo, con la completa assenza di emolisi indicata come ++++

27 Anticorpi incompleti. Reazione di Coombs (diretta e indiretta). Rilevazione di anticorpi contro il fattore Rh nelle donne in gravidanza.

Gli AT incompleti – AT che hanno un solo sito attivo – sono monovalenti.

Reazione di Coombs.

Il metodo rileva gli anticorpi incompleti (monovalenti) formati durante la brucellosi, il conflitto Rh o la collagenosi sistemica. Per mettere in scena una reazione, è necessario un siero antiglobulina contenente anticorpi completi (almeno bivalenti).

Gli anticorpi incompleti, a differenza di quelli normali, sono monovalenti perché hanno un centro attivo che può interagire con un solo epitopo, mentre gli altri epitopi rimangono non legati. Di conseguenza non si formano grandi complessi che precipitano nella soluzione elettrolitica. Questi ultimi compaiono solo nelle reazioni con anticorpi bivalenti. Per correggere questa situazione, viene introdotto il siero antiglobulina (AGS), contenente anticorpi bivalenti contro la globulina, che legheranno tra loro gli anticorpi monovalenti. Contenuto nel materiale in studio. In questo modo si verificherà un'emoagglutinazione o agglutinazione visivamente visibile, che indica la presenza di anticorpi incompleti (monovalenti) nel siero del test. Ad esempio, se una donna Rh negativa rimane incinta di un feto Rh positivo, nel suo siero appariranno anticorpi incompleti. Per identificarli, gli eritrociti Rh positivi e poi l'AGS vengono aggiunti in una provetta con il siero del sangue da testare. La comparsa di emoagglutinazione indica una reazione positiva.

Immunofluorescenza

Reazione di immunofluorescenza (RIF). Sviluppato da A. Koons e porta il suo nome (metodo Koons). Questo è uno dei metodi di ricerca che utilizza anticorpi marcati. Come etichetta viene utilizzato un colorante che si illumina ai raggi ultravioletti (isocianato di fluoresceina o semplicemente fluorocromo). La barriera corallina viene utilizzata in due modifiche: il metodo Koons diretto e il metodo Koons indiretto. Metodo diretto: il materiale da analizzare, fissato su un vetrino, viene trattato con siero diagnostico marcato con fluorocromi; fase obbligatoria della reazione -

lavaggio da anticorpi non reagiti; se il materiale in studio contiene l'antigene desiderato, gli anticorpi marcati vengono fissati sull'antigene e, dopo il lavaggio, tale complesso si rivela alla vista con la sua luminosità

farmaco al microscopio a fluorescenza. Metodo indiretto: in questo caso, la reazione avviene in due fasi: nella prima fase viene utilizzato il siero diagnostico non marcato, nella seconda fase viene utilizzato il siero antiglobulina marcato con fluorocromo; Utilizzando il metodo indiretto è possibile rilevare sia la presenza dell'antigene che

presenza e titolo di anticorpi specifici. I sieri luminescenti (fluorescenti) lo sono

sieri immunitari contenenti anticorpi specifici marcati con coloranti fluorescenti. Quando si preparano sieri luminescenti, i fluorocromi vengono aggiunti alla frazione globulina del siero immune attraverso un forte legame chimico. I sieri luminescenti vengono utilizzati durante l'esecuzione del RIF.

29. Reazione di neutralizzazione– la capacità degli anticorpi di neutralizzare tossine, virus, veleni di serpente. Utilizzato per l'indicazione e l'identificazione delle tossine, per l'identificazione dei virus, ecc. L'RN non fornisce risultati visibili in vitro,

pertanto, viene preso in considerazione utilizzando un test biologico su animali o in colture di tessuti. Il pH in vivo può essere utilizzato per determinare il grado di tensione dell'immunità antitossica nel corpo umano (test di Schick).

La tossina è un veleno di origine microbica. Le tossine microbiche si dividono in endotossine ed esotossine. Caratteristiche delle tossine, vedere l'argomento n. 6.

L'anatossina è una tossina neutralizzata. Ottenuto da esotossine trattandole con formaldeide e calore. L'anatossina non è tossica, ma conserva le proprietà antigeniche e immunogeniche della tossina. Forza

l'azione del tossoide si misura in IE. UI (unità immunogenica) è la quantità di tossoide che, miscelato con 1 UA di siero, dà la flocculazione iniziale. Il titolo tossoide è la quantità di IE in 1 ml.

I tossoidi vengono titolati in una reazione di flocculazione. L'anatossina viene utilizzata come vaccino per creare un'immunità antitossica attiva. Esempi di tali vaccini sono il tossoide difterico e il tetano

toxoid, ecc. Toxoid viene utilizzato anche per ottenere sieri antitossici.

Siero antitossico o antitossico– siero contenente anticorpi contro la tossina. I sieri antitossici sono sieri eterologhi; si ottengono iperimmunizzando i cavalli con i tossoidi appropriati, quindi prelevando il sangue dagli animali e ottenendo il siero. Il contenuto di antitossina nei sieri antitossici è espresso in unità internazionali (UI) adottate dall'OMS. Ad esempio, 1 UI di siero antitetanico corrisponde al suo

la quantità minima che neutralizza 1.000 dosi minime letali (DLm) di tossina tetanica per una cavia di 350 g. 1 UI di antitossina antibotulinica è la più piccola quantità di siero che neutralizza 10.000 DLm di tossina botulinica per topi di peso di 20 g.1 Le UI di siero antidifterico corrispondono alla sua quantità minima che neutralizza 100 DLm di tossina difterica per una cavia del peso di 250 g.

30. Reazione di flocculazione(RF) - utilizzato per la titolazione di sieri antitossici, tossine e tossoidi. La reazione di flocculazione coinvolge una tossina o un'anatossina come antigene. Quando vengono mescolati in proporzioni equivalenti con siero antitossico, appare torbidità e quindi appare un sedimento sciolto. Le reazioni sono possibili solo con sieri antitossici equini (non di coniglio) o con antisieri antitireoglobulina umani. Il meccanismo RF è simile a quello della reazione di precipitazione. Tossine, tossoidi, antitossine (sieri antitossici) partecipano come componenti alle reazioni di neutralizzazione e flocculazione

31. Test immunoenzimatico- un metodo immunologico di laboratorio per la determinazione qualitativa o quantitativa di vari composti, macromolecole, virus, ecc., che si basa su una specifica reazione antigene-anticorpo. L'identificazione del complesso formato viene effettuata utilizzando l'enzima come etichetta per la registrazione del segnale.

Classificazione per tipo di interazione immunochimica nella prima fase dell'analisi (in cui avviene il legame dell'analita). Se il sistema contiene solo il composto analizzato e i suoi corrispondenti centri di legame (antigene e anticorpi specifici), il metodo lo è non competitivo. Se, nella prima fase, il sistema contiene contemporaneamente l’analita e il suo analogo (un analita marcato con un enzima o un analita immobilizzato su una fase solida), in competizione per un numero limitato di siti di legame specifici, allora il metodo è competitivo.

Tra competitivo Esistono due formati principali per gli schemi ELISA in fase solida:

1. Concorrenza diretta Il formato ELISA utilizza anticorpi specifici immobilizzati su una fase solida e un antigene marcato con un enzima e uno non marcato competono per legarsi all'anticorpo immobilizzato.
IN competitivo indiretto Il formato ELISA utilizza anticorpi marcati con enzima (specifici o secondari) e un coniugato antigene-proteina-trasportatore immobilizzato sulla fase solida.
Pertanto, a causa degli indubbi vantaggi del test immunoenzimatico: facilità d'uso, velocità, obiettività grazie all'automazione della registrazione dei risultati, la capacità di studiare immunoglobuline di varie classi (che è importante per la diagnosi precoce delle malattie e la loro prognosi) è attualmente uno dei principali metodi di diagnostica di laboratorio.

Principali tipologie di sistemi di test (kit diagnostici) a seconda degli antigeni utilizzati

A seconda degli antigeni utilizzati, i sistemi di test immunoenzimatici sono suddivisi in:

1. Lisato - in cui viene utilizzata una miscela di antigeni nativi (un agente infettivo lisato o trattato con ultrasuoni ottenuto in coltura);

2. Ricombinante - che utilizza proteine ​​geneticamente modificate che sono analoghi di alcuni antigeni proteici dell'agente patogeno;

3. Peptide: utilizza frammenti proteici sintetizzati chimicamente.

Teorie dell'immunità

1) Teoria dell'immunità di Ehrlich(teoria delle catene laterali) è una delle prime teorie sulla formazione di anticorpi, secondo la quale le cellule hanno recettori antigene-specifici che vengono rilasciati come anticorpi sotto l'influenza di un antigene.

2) Teoria clonale-selettiva, La teoria di Burnet- la teoria secondo la quale nell'organismo compaiono cloni di cellule immunocompetenti per vari antigeni; l'antigene contatta selettivamente il clone corrispondente, stimolandone la produzione di anticorpi.

1. Anticorpi e linfociti con la necessaria specificità esistono già nell'organismo prima del primo contatto con l'antigene.

2. I linfociti coinvolti nella risposta immunitaria hanno recettori antigene-specifici sulla superficie delle loro membrane. Nel caso dei linfociti B, i recettori sono molecole con la stessa specificità degli anticorpi che questi linfociti successivamente producono e secernono.

3. Ogni linfocita porta sulla sua superficie recettori di una sola specificità.

Un linfocita sensibilizzato da un antigene attraversa diverse fasi di proliferazione e forma un clone di plasmacellule. Le plasmacellule sintetizzano anticorpi solo con la specificità per la quale è stato programmato il linfocita precursore. I segnali per la proliferazione sono il legame dell’antigene e le citochine rilasciate da altre cellule (principalmente le cellule T helper. Anche gli stessi linfociti B attivati ​​rilasciano citochine.

3) Teoria selettiva della formazione di anticorpi Erne ha formulato, ha suggerito che il corpo sintetizza un set completo di anticorpi, ma ciascuno di essi si forma in piccole quantità e, indipendentemente da qualsiasi stimolo, entra nel sangue sotto forma di anticorpi naturali. La loro funzione è quella di legarsi selettivamente all'antigene corrispondente e di consegnarlo in questo modo a determinate cellule del corpo, per le quali fungono da segnale per riprodurre le stesse molecole, cioè alla formazione di anticorpi. Questa fu la prima teoria che spiegò anche il fenomeno della tolleranza immunologica, partendo dal presupposto che eventuali anticorpi naturali diretti contro gli antigeni self sarebbero stati immediatamente assorbiti dai tessuti dell'organismo e quindi non avrebbero potuto innescare la formazione di autoanticorpi.

34. Tolleranza immunologica- la capacità del sistema immunitario di non rispondere specificamente ad un antigene specifico. Durante la gravidanza, ad esempio, il sistema immunitario della madre sviluppa tolleranza

Immunodiagnostica

L’immunodiagnostica è l’identificazione di un agente patogeno, dei suoi derivati ​​immunologicamente attivi o dei fattori di risposta immunitaria dell’organismo sintetizzati in risposta alla loro introduzione, utilizzando farmaci immunodiagnostici specifici.

I farmaci immunodiagnostici, chiamati semplicemente farmaci diagnostici, sono disponibili in diversi tipi : antigene, immunoglobulina e anticorpo.

I diagnostici antigenici sono preparati diagnostici a base di microbi, ovvero virus, tossine, funghi, ecc. (preparati microbi-virali-tossinici), destinati alla determinazione degli anticorpi nelle reazioni immunologiche dirette o dell'antigene in quelle indirette.

I diagnostici anticorpali sono preparati diagnostici a base di globuline di sieri immunitari o anticorpi, progettati per rilevare l'antigene nelle reazioni immunologiche dirette o gli anticorpi in quelle indirette.

I diagnostici delle immunoglobuline sono preparati a base di immunoglobuline sieriche normali, in base alle proprietà effettrici della molecola IG. Le IG sul frammento Fc hanno recettori per legare alcuni agenti, ad esempio il componente C3 del sistema del complemento, la proteina A dello Staphylococcus aureus, i linfociti T e B, i macrofagi e gli anticorpi contro le immunoglobuline, ecc. Questa connessione non viene effettuata dal tipo antigene-anticorpo, ma potrebbe essere necessario determinare la proteina C-reattiva, effettuare una rapida indicazione dello stafilococco utilizzando la proteina A, ecc. Per questi scopi viene preparato un diagnostico immunoglobulinico.

Ad oggi sono stati sviluppati moltissimi immunoreagenti e reazioni immunologiche (più di 200), che richiedono una certa sistematizzazione.

Offriamo la nostra classificazione delle reazioni immunologiche in forma abbreviata. Quando si classificano le reazioni immunologiche, è necessario chiarire : Si verificano in vivo (nel corpo) o all'esterno del corpo, in un esperimento (in vitro). Inoltre, le reazioni immunologiche devono essere divise in cellulari - con la partecipazione di linfociti e umorali - con la partecipazione di anticorpi. Pertanto, un breve schema (generale) delle reazioni immunologiche può essere illustrato come segue :

REAZIONI IMMUNOLOGICHE

perditeIn vivo. riproducibileIn vitro

(reazioni immunitarie) (immunodiagnostica)

umorale cellulare sierologico cellulare

In questa sezione siamo interessati alle reazioni sierologiche riproducibili in vitro. Lo schema completo delle reazioni immunologiche è presentato nella monografia di V.A. Shamardina e altri (1989). Dividiamo le reazioni immunologiche in base alla caratteristica principale : procedendo a seconda del tipo antigene-anticorpo o del tipo effettore. In questa sezione siamo interessati a quelle reazioni che si verificano come tipo antigene-anticorpo. Dovrebbero essere distinti dal fenomeno che visualizza l'interazione degli immunoreagenti (ad esempio il fenomeno dell'agglutinazione, ecc.).

È consigliabile dividere le reazioni basate su un fenomeno specifico in grandi gruppi che hanno una natura comune di interazione (diretta, indiretta, sedimentaria, diffusione, ecc.). Questo schema si riflette nella tabella n. 15.

Tabella n. 15.

Reazioni immunodiagnostiche riproducibili in vitro

Fenomeni di reazioni immunodiagnostiche
Agglutinazioni	Consumo complemento	Immunofluorescenza	Precipitazione	Neutralizzazione	Immunoconiugazione- azioni
gruppi di reazioni immunodiagnostiche
UN. Dritto B. indiretto c.frenata g. assorbimento	B. indiretto V. frenatura	b.indiretto c.frenata	UN. sedimentario B. diffusione	UN. cancellazioni Azioni b.neutralizzazione	UN. Dritto b.indiretto V. frenatura

Fenomeni immunologici

Il fenomeno dell'agglutinazione. Il fenomeno si basa sull'interazione di anticorpi e antigeni con la formazione di un caratteristico precipitato (agglutinato). In questo caso, almeno uno dei reagenti deve essere in forma cellulare o sotto forma di diagnostico cellulare.

Il metodo diretto dovrebbe includere tutte le varianti di interazione delle cellule con gli anticorpi (agglutinazione di batteri, globuli rossi, cellule dei tessuti umani, ecc.). Il metodo diretto comprende tipi di microbi RA, agglutinazione piastrinica, emoagglutinazione, ecc.

Il metodo indiretto comprende tutte le varianti di interazione tra antigene e anticorpi, quando uno di essi è sotto forma di fluido diagnostico (lattice, eritrociti, alizarina, bentonite, carbone, ecc.). Il metodo indiretto consiste in reazioni di emoagglutinazione indiretta a due componenti (IRHA), varianti di coagglutinazione, determinazione dell'antigene in forma adsorbita (POCA), ecc.

Il metodo di inibizione comprende reazioni complesse multicomponente, la prima fase delle quali è la neutralizzazione dell'agente solubile sospettato nel materiale in esame mediante antisiero (o anticorpi del siero in esame - antigene), la seconda fase è la visualizzazione di questa interazione mediante introduzione nella miscela diagnostici omologhi (anticorpi, nel secondo caso - antigenici o sospensione di diagnostici batterici). Il risultato delle interazioni a più stadi sarà un agglutinato. Il metodo di inibizione include reazioni : ritardo dell'agglutinazione diretta e dell'emoagglutinazione (rispettivamente RZA, RTHA), opzioni per l'inibizione dell'emoagglutinazione indiretta (RTIGA), soppressione dell'emoagglutinazione indiretta (IRH), determinazione della classe di anticorpi agglutinanti (ROCA), ecc.

Il metodo per determinare un agente specificamente assorbito comprende reazioni complesse e multicomponenti, il primo stadio dei quali è il legame specifico di un antigene da parte di un anticorpo diagnostico (o anticorpi da parte di un antigene diagnostico), e il secondo stadio è l'agglutinazione del complesso da parte di anticorpi , nel secondo caso da un antigene. Il metodo include reazioni : Metodo di Coombs indiretto, determinazione dell'aptene (HOG), inibizione dell'emoagglutinazione indiretta (RUNGA), reazione di scollamento degli eritrociti (RRE).

Il fenomeno del consumo di complemento. Il fenomeno si basa sull'interazione tra anticorpi e antigene in presenza di complemento

Il metodo diretto comprende tipi di lisi cellulare durante la loro reazione diretta con anticorpi in presenza di complemento (batteriolisi, emolisi, trombocitolisi, ecc.).

Il metodo indiretto include opzioni per la lisi dei globuli rossi nativi caricati con antigene a causa dell'interazione con gli anticorpi in presenza di complemento. Il metodo indiretto è rappresentato dalle reazioni : batteriolisi indiretta (i batteri sono carichi di virus) ed emolisi indiretta (gli eritrociti sono carichi di antigene).

Il metodo con un sistema indicatore comprende un ampio gruppo di reazioni multicomponente, a due o più sistemi basate sulla lisi delle cellule indicatrici. Come cellule indicatrici viene solitamente utilizzato il sistema emolitico (eritrociti nativi di pecora caricati con siero emolitico). La prima fase è l'interazione dell'antigene solubile e degli anticorpi (uno dei componenti è nel materiale del test) in presenza del complemento. La seconda fase è l'introduzione di un sistema di indicatori, in base al cui stato (lisi eritrocitaria o meno) viene giudicata la presenza di anticorpi (o antigene) nel materiale di prova. Il metodo costituisce le reazioni : Bordet-Gengou, consumo del complemento (CPC), varianti di fissazione del complemento (CFV) - in fase liquida e su un mezzo solido (in gel).

Il metodo di inibizione comprende anche un gruppo di reazioni, nella prima fase delle quali il complemento viene adsorbito dal complesso antigene-anticorpo, che viene registrato nella seconda fase, introducendo un antigene cellulare (inibizione del metodo diretto) o un diagnosticum sul eritrociti nativi (inibizione del metodo indiretto) o un sistema eme su eritrociti nativi ram. I metodi includono : reazione di neutralizzazione della lisi microbica (RNLM), inibizione dell'emolisi indiretta (RTNGem), soppressione della fissazione del complemento (RPSC).

Il fenomeno dell'immunofluorescenza. Il fenomeno si basa sull'interazione di cellule adsorbite su un vetrino con sieri immunitari premarcati con un colorante fluorescente. Ciò porta ad un bagliore caratteristico del complesso se osservato al microscopio a fluorescenza.

Il metodo diretto comprende opzioni per l'interazione diretta di cellule (tessuti, microbi, ecc.) con anticorpi marcati, ad esempio reazione di immunofluorescenza diretta (DIFR), reazione di immunofluorescenza in un preparato macinato (RIFPP), ecc.

Il metodo indiretto comprende opzioni per rilevare l'interazione del complesso antigene-anticorpo mediante l'aggiunta di un anticorpo diagnostico marcato. Il metodo include reazioni : anticorpi fluorescenti della cellulosa (RCFA), immunofluorescenza indiretta (RIFN), immunofluorescenza con dischetti di carta (RIFBD), immunofluorescenza del complemento (RIFC).

L'inibizione dell'immunofluorescenza comprende reazioni multicomponente basate sulla competizione per l'interazione con l'antigene omologo degli anticorpi marcati e degli anticorpi del siero in esame: la reazione di quenching dell'immunofluorescenza (RIFT).

Il fenomeno delle precipitazioni. Basato sull'interazione di molecole di antigene e anticorpo solubili in fase liquida o in gel. Ciò porta alla formazione di un aggregato fine (precipitato).

I metodi per la formazione del precipitato nella fase liquida includono reazioni : Provetta Kraus, precipitazione ad anello di Ascoli, precipitazione capillare, flocculazione e varie reazioni sedimentarie (Cahn, Sachs-Vitebsky, ecc.).

Il metodo, basato sull'interazione di molecole di antigene e anticorpo solubili in un gel, secondo il principio della diffusione dei componenti, consiste in reazioni: semplice diffusione unidimensionale e bidimensionale, immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi e sue modifiche.

Il fenomeno della neutralizzazione. Si basa sulla registrazione della reazione degli anticorpi con agenti patogeni (microbi, virus, ecc.) o con le loro tossine. Ciò porta alla neutralizzazione dell'agente patogeno o al suo effetto patogeno sul corpo.

Il metodo di immobilizzazione è rappresentato dalle reazioni : immobilizzazione dei treponemi, adesione immunitaria, immobilizzazione del Vibrio cholerae, inibizione del metabolismo microbico.

Il metodo per estinguere l'effetto patogeno è : neutralizzazione dell'effetto infettivo (negli animali, embrioni di pollo e colture di tessuti) tenendo conto dei risultati della loro interazione in termini di letalità, formazione di placche, emoagglutinazione, proprietà emolitiche della tossina, effetto necrotico della tossina, ecc.

Il fenomeno dell'immunoconiugazione. Basato sull'interazione di antigeni solubili e anticorpi sulla fase solida. La rilevazione del complesso viene effettuata identificando l'etichetta.

Per la natura del marchio, il fenomeno è composto da diverse famiglie : radioimmune (RIA), immunoenzimatico (ELISA), immunomagnetico (IMA), immunospettrale (ISA), ecc.

La famiglia delle reazioni radioimmuni comprende: varianti del test radioimmunometrico (RIA), analisi immunoradiometrica (IRMA), test di radioassorbimento (RIST e RAST), test radioimmune a sandwich solido (TSRIT), ecc.

La famiglia delle reazioni immunoenzimatiche comprende : metodo di potenziamento enzimatico (IFU), metodo immunoassorbente legato a un enzima (ELISA), varianti del test immunoassorbente legato a un enzima sandwich (TSIFA), ecc.

A loro volta questi grandi gruppi di reazioni dovrebbero essere ulteriormente suddivisi in dirette, indirette e di inibizione (prove competitive).

Tipi di reazioni immunologiche

In questa sezione non possiamo presentare l'intero spettro delle reazioni immunodiagnostiche, che oggi sono più di 200. Presentiamo le reazioni selettive secondo la tassonomia (per una o più reazioni, per quasi tutti i gruppi di tutti i fenomeni). .

Fenomeno dell'agglutinazione

Metodo diretto. È il processo di interazione tra anticorpi omologhi e cellule (tessuti, microrganismi, globuli rossi, piastrine, ecc.) con successiva precipitazione del complesso (agglutinato).

Per eseguire la reazione di agglutinazione del RA, è necessario :

1. Solvente: soluzione di cloruro di sodio allo 0,85%.

2. Sospensione batterica nota al 2%.

3. Testare il siero.

Vetrini, anse batteriologiche, lampada ad alcool.

La cultura studiata.

Set di sieri agglutinanti. La reazione di agglutinazione viene eseguita in due varianti : in forma espansa in provette e sotto forma di metodo indicativo - goccia a goccia su un vetrino.

1. Versione ampliata di RA.

La reazione non è attualmente utilizzata.

2. Versione a goccia di RA.

Utilizzato per la determinazione rapida degli anticorpi nel siero del sangue posizionando l'AR su un vetrino con un test diagnostico noto o tipizzando una coltura pura di microbi con un antisiero noto.

Tipizzazione colturale: una goccia di siero noto in diluizione 1:10 (o secondo le istruzioni) viene applicata su un vetrino e una goccia di solvente viene applicata separatamente. La coltura microbica tipizzata viene introdotta nella prima goccia utilizzando un'ansa batterica e distribuita in tutta la goccia.

L'ansa viene bruciata in una lampada ad alcool e la coltura viene nuovamente raccolta, distribuendola nella seconda goccia. Il circuito viene bruciato e messo in posizione. Dopo alcuni minuti, i risultati vengono registrati.

Se la coltura tipizzata è omologa in specificità agli anticorpi nel siero, si osserverà l'aggregazione, ad es. la formazione di scaglie in una goccia è un risultato positivo.

Quando si determinano gli anticorpi, vengono preparate anche due gocce: una dal siero del test e la seconda da una soluzione di cloruro di sodio allo 0,85%. Aggiungere 1 goccia di diagnosticum batterico ad entrambe le gocce (1 miliardo di sospensione). Tra pochi minuti appariranno i risultati dell'AR indicativa. Se nel siero in esame sono presenti anticorpi omologhi al diagnosticum, si osserverà la flocculazione (questo è un risultato positivo). Se il risultato è negativo (assenza di anticorpi nel siero del test), entrambe le gocce rimangono uniformemente torbide.

Metodo indiretto. A causa della grande varietà dei mezzi diagnostici (lattice, eritrociti, Co-, ecc.), è necessario classificarli.

Le differenze tra i diagnostici sono determinate dalla natura dell'agente immunologicamente attivo caricato su un supporto insolubile.

Diagnostici

immunoglobulina anticorpi antigenico

proteina non proteico

I diagnostici sono progettati per rilevare l'antigene e determinare gli anticorpi in varie secrezioni umane, nonché nei fluidi biologici utilizzando reazioni immunologiche semplici e complesse.

1. RNHA - reazione di emoagglutinazione indiretta.

Per impostare una reazione devi avere:

1. Farmaco diagnostico.

2. Solvente: soluzione di cloruro di sodio allo 0,85% contenente tampone fosfato al 2%, pH 7,2 e siero di cavallo normale in un volume dello 0,4%.

3. Pannelli in polistirolo, micropiastre tipo Takachi, pipette graduate, beute, fiale, provette, supporti.

4. Inattivatore per sieri di prova.

Globuli rossi di pecora formalizzati, sospensione al 50%.

Organizzato da RNGA. Questa è una reazione bicomponente, effettuata in 2 varianti : in pannelli di polistirolo (opzione macro), in micropiastre tipo Takachi (opzione micro).

Opzione macro.

La reazione viene effettuata in 2 fasi.

Fase 1. Diluizioni seriali del siero sanguigno del paziente vengono preparate come di consueto in un volume di 0,5 ml nei pozzetti di una piastra di polistirolo. A tale scopo, aggiungere 0,5 ml di solvente a tutti i pozzetti di una fila della piastra e 0,5 ml del siero in esame diluito 1:50 al primo pozzetto. Dal primo pozzetto, 0,5 ml della miscela vengono trasferiti al secondo pozzetto, miscelati e 0,5 ml vengono trasferiti al terzo, ecc. L'ultimo pozzetto viene lasciato come pozzetto di controllo (senza siero). Il siero può essere trasferito mediante pipetta o dispenser da 0,5 ml.

Fase 2. Il diagnostico eritrocitario antigenico (AED) viene aggiunto a tutti i pozzetti in 0,5 ml di sospensione allo 0,5% o secondo le istruzioni. Contabilità dei risultati dopo 1,5-2,0 ore (vedi tabella n. 17).

Micrometodo. Preparare diluizioni seriali del siero in esame in un volume di 0,05 ml in una micropiastra tipo Takachi, come indicato in precedenza. Il trasferimento di 0,05 ml nei pozzetti viene effettuato utilizzando un dispenser o un mixer con un volume di testa di 0,05 ml. L'ultima buca è il controllo. Una goccia (0,025 ml) di diagnosticum allo 0,5% viene aggiunta a tutti i pozzetti. Tenendo conto della reazione di emoagglutinazione dopo 1,5-2,0 ore.

Tabella n. 17.

Schema di realizzazione di una versione ampliata della RNGA

ingredienti	Bene numeri e quantità degli ingredienti, in ml
Ricercato siero, 1:50
Solvente
Ricevuto allevamento
DAE, sospensione al 5%.
Risultato RNGA
Titolo RNGA	Il titolo RNGA è una diluizione del siero di 1:3200

Nel primo e nel secondo caso, invece del siero in esame, si può titolare un altro materiale di prova contro un antigene (coproestratto, urina, ecc.) e si può aggiungere un anticorpo eritrocitario diagnostico (ATED).

I risultati dell’RNGA vengono presi in considerazione secondo il seguente schema:

1. Agglutinare a ++++. I globuli rossi coprono l'intero fondo del foro con un ampio "ombrello".

2. Agglutinare a +++. I globuli rossi coprono quasi l'intero fondo del foro.

3. Agglutinare su ++. Il sedimento è piccolo, al centro del buco.

4. Non c'è agglutinato sul fondo o ha la forma di un piccolo anello. Questo è un risultato negativo.

Con risultato positivo si ottiene un agglutinato a forma di ombrello quando gli anticorpi del siero in esame reagiscono con il diagnostico antigenico. Se nel siero non sono presenti anticorpi, tutti i pozzetti avranno una reazione negativa sotto forma di un piccolo anello.

Utilizzando RNGA è possibile determinare fino a 15mila cellule (microbo della peste), fino a 1 milione di cellule (Escherichia, Proteus, ecc.) e più corpi microbici o da 0,01 a 0,0001 μg per ml di antigene solubile. Svantaggio del metodo : Dell'intera massa di anticorpi o antigeni attivi, viene determinata solo una parte di essi, i cosiddetti completi o agglutinanti. RNGA è stato sviluppato nel 1945 da Middlebrook e Dubos.

La stadiazione a goccia dell'RNGA viene effettuata in accordo con quanto descritto per l'AR, esclusa la tipizzazione; il diagnosticum non è batterico, ma AED.

Reazione di coagglutinazione (RCoA).

È noto che la proteina di superficie A dello Staphylococcus aureus ceppo Covan 1 può legarsi a un sito sul frammento Fc delle IgG umane, di cavia, ecc.. Allo stesso tempo, i frammenti Fab delle IgG con il centro attivo degli anticorpi sono liberi e disponibile per l'interazione con microbi, tossine, ecc. In questo modo si ottiene un anticorpo diagnostico mirato, poiché in altri casi di preparazione di diagnostici gli anticorpi verranno localizzati in modo casuale sul trasportatore.

Una coltura giornaliera del ceppo Covan 1 viene lavata via dall'agar con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,85% e lavata due volte mediante centrifugazione a 3000 vol. al minuto per 15 minuti, portando la sospensione batterica al 10%. Fissare e uccidere le cellule facendo bollire per 1 min.

Ad un volume di sospensione di stafilococco al 10%, aggiungere un volume uguale di siero immune ad una diluizione di 1:20, specifico per l'agente rilevabile nel materiale del test (ad esempio, Shigella zonna), sospensione impoverita (adsorbita) di stafilococco saprofita , al fine di rimuovere gli anticorpi anti-stafilococco. La miscela viene incubata a temperatura ambiente per 30 minuti e lavata due volte mediante centrifugazione. Il sedimento stafilococcico deve essere risospeso e poi conservato con sodio azide allo 0,1%. Pertanto, è stato preparato un anticorpo Co-diagnosticum.

Mettere due gocce su un vetrino : La prima goccia è un coproestratto testato per Shigella zonne e la seconda goccia è una soluzione di cloruro di sodio allo 0,85%. Aggiungere 1 goccia di Co-diagnosticum preparato ad entrambe le gocce. Entro 40-60 secondi compaiono delle scaglie (questa è una reazione positiva se nel materiale è presente Shigella sonne). Il controllo mostrerà una torbidità uniforme. In assenza di Shigella sonne (nel nostro esempio), l'esperimento avrà la stessa torbidità fine uniforme del controllo.

Inibizione del metodo. Si tratta di reazioni complesse a due stadi e multicomponente.

HAI - reazione di inibizione dell'emoagglutinazione.

Questa reazione si riferisce all'inibizione di un gruppo diretto di reazioni, è utilizzata principalmente in virologia e si riferisce anche al fenomeno della neutralizzazione, dove verrà descritta.

BRTBA - reazione di inibizione dell'agglutinazione batterica.

La reazione non viene applicata.

RTNHA 1 - reazione di inibizione dell'emoagglutinazione indiretta 1.(Sinonimi : RNAg - se il diagnostico è un anticorpo, RNAb - se il diagnostico è antigenico).

Il metodo viene eseguito in 4 fasi.

Fase 1. Una dose di lavoro di antisiero viene preliminarmente selezionata eseguendo un RNGA convenzionale con AED. Viene determinato il titolo di questo antisiero (la diluizione massima che dà un risultato positivo con l'AED). Come dose di lavoro viene utilizzata una diluizione 3-4 volte più concentrata del titolo RNHA.

Fase 2. Diluizioni seriali del materiale di prova per l'antigene vengono preparate come di consueto, in un volume di 0,25 ml nella quantità di 6 pozzetti in pannelli di polistirene, lasciando il sesto pozzetto come controllo per il test diagnostico. Al posto del materiale di prova, nella riga di controllo viene aggiunto un solvente.

Fase 3. Quindi l'antisiero dell'antigene presunto viene aggiunto a tutti i pozzetti di due file in un volume di 0,25 ml in una dose di lavoro. La miscela viene agitata e lasciata per 30 minuti a temperatura ambiente.

Fase 4. Dopo l'esposizione, in tutti i pozzetti viene aggiunta una goccia di una sospensione al 5% di antigene eritrocitario diagnostico, omologo per specificità all'antisiero. Il pannello viene agitato e lasciato per 1,5-2,0 ore a temperatura ambiente. Se nel materiale è presente un antigene, avviene la neutralizzazione dell'antisiero noto nei pozzetti dell'anticorpo, dove l'antigene è ancora in una concentrazione significativa. Ci sarà una reazione negativa in questi pozzetti (Tabelle 18 e 19).

Nei pozzetti successivi, l'antisiero predominerà poiché l'antigene viene ridotto a causa delle sue diluizioni nei pozzetti. Ciò dovrebbe manifestarsi come una reazione positiva (PRGA). Se nel materiale non è presente antigene, tutti i pozzetti saranno positivi per RNGA.

Tabella n. 18.

Selezione della dose di lavoro dell'antisiero per RTNHA 1

ingredienti	Bene numeri e quantità degli ingredienti, ml
Famoso siero 1:100
Solvente
Diluizioni risultanti
Esposizione 45 minuti a temperatura ambiente
Risultato RNGA
Titolo RNGA e dose di lavoro dell'antisiero	Il titolo dell'antisiero è una diluizione di 1:1600 e la dose di lavoro è (1:1600) : 3 = 1:533 .