Metodi di ricerca elmintologici. Metodi di ricerca immunologica. Capitolo v. metodi di ricerca qualitativa
Metodi semplici
Metodo macroscopico. Durante l'esame delle feci, puoi trovare elminti, le loro teste, segmenti e frammenti di strobila, rilasciati indipendentemente o dopo la sverminazione. Questo metodo è particolarmente indicato per identificare enterobiasi, taeniasi e taeniarincosi.
Piccole porzioni di feci vengono mescolate con acqua in un bagno piatto o in una capsula di Petri e osservate buona illuminazione su fondo scuro, eventualmente utilizzando una lente d'ingrandimento, eliminare gli elminti e tutte le formazioni sospette bianco pinzette o pipetta. Il materiale raccolto viene trasferito in un'altra tazza con acqua o su un vetrino in una goccia di glicerolo diluito o di una soluzione isotonica di cloruro di sodio per ulteriori studi.
Con il metodo di sedimentazione, l'intera porzione di feci da testare deve essere mescolata con acqua in un cilindro di vetro, quindi lo strato superiore d'acqua deve essere accuratamente drenato. Questo viene ripetuto più volte. Quando il liquido diventa limpido, viene drenato e il sedimento viene esaminato in piccole porzioni in un bagno di vetro o in una capsula di Petri, come indicato sopra.
I metodi microscopici sono il modo principale per esaminare le feci per rilevare uova o larve di elminti. Vari metodi gli studi sono descritti di seguito. Per aumentare l'affidabilità dell'esame, i test possono essere ripetuti più volte al giorno o con un intervallo di 1-3 giorni.
Metodo dello striscio nativo. Uno striscio nativo è il metodo più comune e tecnicamente accessibile per esaminare le feci. In uno striscio nativo è possibile rilevare uova e larve di elminti di tutti i tipi. Tuttavia, se il numero di uova nelle feci è piccolo, non sempre è possibile trovarle. Pertanto, l'esame delle feci utilizzando solo uno striscio nativo non è completo e deve essere integrato con metodi di arricchimento. L'efficienza dell'esame di uno striscio nativo è notevolmente migliorata visualizzando quattro vetrini preparati da un campione di feci su due vetrini senza vetrini coprioggetto, consentendo di esaminare un totale di circa la stessa quantità di feci come con il metodo Kato (vedere di seguito).
Una piccola quantità (delle dimensioni di una testa di fiammifero) di feci miste viene spalmata sottilmente con un bastoncino di legno sulla superficie di un vetrino in una goccia di soluzione di glicerina al 50%. Di solito vengono preparati due strisci su un vetrino. Lo striscio viene osservato al microscopio a basso ingrandimento (vol. 8, circa 7). Nei casi dubbi, viene coperto con un vetrino coprioggetto ed esaminato ad alto ingrandimento (ingrandimento 40).
Per preparare un grande striscio nativo, 200-300 mg di feci (le dimensioni di un grosso pisello) vengono macinati su un vetro di 6x9 cm in 15-20 gocce di una soluzione acquosa al 50% di glicerolo. Vista al microscopio stereoscopico binoculare (obv. 4, circa 12,5 o ob. 2, circa 17) in luce trasmessa senza vetri protettivi. In casi dubbi è possibile impostare l'obiettivo su un ingrandimento maggiore. In tali strisci, le grandi uova colorate di elminto sono chiaramente visibili, mentre le uova trasparenti della tenia nana sono leggermente peggiori. Questo metodo non è adatto per rilevare uova piccole. Allo stesso tempo, un grande volume del materiale in studio e un ampio campo visivo con un'elevata profondità di campo garantiscono un'efficacia significativa di questa modifica rispetto a uno striscio nativo convenzionale.
Lo striscio spesso con cellophane (metodo Kato) è più efficace dello studio di uno striscio nativo, ma richiede anche la combinazione con metodi di arricchimento. Vengono rilevate uova di tutti i tipi di elminti, tuttavia, per individuare uova di tenia nana (uova trasparenti) o di opisthorchide (uova piccole), il tecnico di laboratorio deve prestare particolare attenzione a non perderle (Fig. 21).
Il metodo si basa sul rilevamento delle uova di elminto in uno spesso strato di feci, schiarite con glicerina e colorate con verde malachite. Il cellophane preidrofilo viene tagliato in piastre di 20 x 40 mm e immerso nella miscela di Kato (6 ml di una soluzione acquosa al 3% di verde malachite, 500 ml di glicerina, 500 ml di una soluzione di fenolo al 6%). 3-5 ml di miscela sono sufficienti per 100 piastre, pronte all'uso in un giorno e possono essere conservate nella stessa miscela in un contenitore ben chiuso a temperatura ambiente per 6 mesi. In assenza di verde malachite (consigliato per ridurre l'affaticamento degli occhi per gli assistenti di laboratorio) e fenolo ( disinfettante) puoi utilizzare solo il 50% soluzione acquosa glicerolo, l'efficacia dello studio non è ridotta.
Riso. 20. Metodo per preparare uno striscio di feci spesse con cellophane secondo Kato
100 mg di feci vengono applicati su un vetrino, coperto con una piastra di cellophane trattata come sopra indicato e pressato con un tappo di gomma in modo che le feci non si diffondano da sotto il cellophane. La microscopia a basso o alto ingrandimento del microscopio viene eseguita entro e non oltre 1 ora (nella stagione calda - 30-40 minuti) dopo la preparazione dello striscio. Il motivo dell'opacità del farmaco potrebbe essere uno spesso strato di feci, una scarsa lavorazione della piastra nella miscela Kato o un periodo insufficiente di esposizione del farmaco sotto cellophane. Anche la pulizia prolungata con glicerina e l'eccessiva essiccazione del preparato rendono difficile il rilevamento delle uova.
Metodo di torsione secondo S.S. Shulman. Il metodo è proposto per il rilevamento delle larve di elminti, principalmente strongiloidi, nelle feci. Vengono esaminate solo le feci appena espulse, di cui vengono trasferiti 2-3 g barattolo di vetro, mescolare con una bacchetta di vetro con un movimento circolare con 3-5 volte la quantità di soluzione salina senza toccare le pareti del vaso. Al centro si accumulano uova e larve di elminti. Una volta completata la miscelazione, la goccia all'estremità del bastoncino viene rapidamente trasferita su un vetrino, coperta con un coprioggetto ed esaminata al microscopio.
Metodi di arricchimento. I metodi di arricchimento si basano sulla differenza tra il peso specifico delle uova e la soluzione salina utilizzata, che consente di rilevarli una piccola quantità di. Se il peso specifico delle uova è maggiore del peso specifico del liquido, le uova vengono concentrate in un sedimento, che viene esaminato al microscopio. Questo metodo di sedimentazione viene utilizzato per le uova di trematodi. Con un peso specifico più elevato della soluzione, le uova galleggiano sulla superficie del liquido e quindi viene esaminato il film. Questi sono metodi di flottazione (fluttuanti), sono più efficaci per rilevare le uova di anchilostomi, tricocefali e tenie nane.
Metodi di flottazione. Il metodo Fulleborn si basa sul galleggiamento delle uova di elminti in una soluzione satura di cloruro di sodio, che ha un'elevata densità relativa (1,2), che rende possibile il rilevamento delle uova in piccole quantità. Il metodo è più efficace dello studio di uno striscio nativo, sebbene sia più complicato. I vantaggi del metodo sono il basso costo e l’accessibilità. Si consiglia di combinare lo studio dello striscio nativo e del metodo Fulleborn.
Una soluzione satura si prepara sciogliendo 400 g di cloruro di sodio in 1 litro di acqua facendo bollire. La densità relativa della soluzione è 1,18-1,22. La soluzione è conservata in una bottiglia chiusa. Per effettuare l'analisi, si mettono 2-3 g di feci in un barattolo con un volume di 30-50 ml e, mescolando con un bastoncino, si aggiunge quasi fino in fondo una soluzione satura di cloruro di sodio. Utilizzare una striscia di carta per rimuovere rapidamente eventuali galleggianti particelle di grandi dimensioni. Dopo 45-60 minuti. Dopo la stabilizzazione con un'ansa metallica, rimuovere la pellicola superficiale e trasferirla su un vetrino in una goccia di soluzione acquosa di glicerolo al 50%. Invece di rimuovere la pellicola con un cappio, puoi aggiungere la soluzione nel barattolo verso l'alto, coprire con un vetrino, sulla cui superficie si attaccano le uova galleggianti. Sono in corso diversi preparativi. Inoltre, vengono esaminate 2-4 preparazioni del sedimento, raccogliendolo con una pipetta oculare su 2 vetrini. Oltre al film superficiale, è necessario esaminare anche il sedimento, poiché le uova di trematodi, taeniidi e uova di nematodi non fecondate non galleggiano in questa soluzione. Le uova di un certo numero di elminti non galleggiano immediatamente in superficie in una soluzione salina. Quindi, se il numero massimo di uova di tenia nana emerge dopo 15-20 minuti, allora gli ascaridi - dopo 1,5-2 ore, i tricocefali - dopo 2-3 ore.
Pertanto, i vantaggi di questo metodo includono il basso costo e la disponibilità, gli svantaggi sono la necessità di visualizzare i preparati sulla pellicola superficiale e sui sedimenti, nonché la durata della sedimentazione.
Anche il metodo di E.V. Kalantaryan è un metodo di arricchimento, ma è più efficace e più semplice del metodo Fulleborn. Viene utilizzata una soluzione satura di nitrato di sodio con una densità relativa di 1,38. Pertanto, le uova della maggior parte degli elminti galleggiano e si trovano nella pellicola superficiale, non è necessario l'esame del sedimento.
Per preparare una soluzione satura di nitrato di sodio, 1 kg di sale di nitrato di sodio (nitrato di sodio) viene sciolto in 1 litro di acqua e fatto bollire fino a completa dissoluzione e si forma una pellicola sulla superficie. Senza filtrare, versare in una bottiglia asciutta. In assenza di nitrato di sodio, può essere sostituito con nitrato di ammonio (nitrato di ammonio), sciogliendo 1,7 kg per 1 litro di acqua. La densità relativa della soluzione risultante è 1,3, il che riduce leggermente l'efficienza rispetto a una soluzione di nitrato di sodio.
Vantaggi del metodo: le uova della maggior parte degli elminti galleggiano rapidamente e si trovano nella pellicola superficiale, eliminando la necessità di esaminare il sedimento. Gli svantaggi del metodo sono la carenza di nitrato di sodio, nonché il fatto che le uova di trematodi e le oncosfere di taeniidi non galleggiano e rimangono nel sedimento. Bisogna tenere conto che quando le feci vengono tenute in soluzione per lungo tempo (più di 1-2 ore), le uova di alcuni elminti iniziano a gonfiarsi e depositarsi, scomparendo dalla pellicola superficiale.
Metodi di sedimentazione
Il metodo di P. P. Goryachev si basa sul principio della sedimentazione delle uova. In questo caso lo striscio risulta essere leggero, senza impurità grossolane, il che rende più facile rilevare piccole uova di trematodi (opistorchide, ecc.). Il peso specifico delle uova di opisthorch è elevato, quindi non galleggiano in soluzioni saline.
70-100 ml di soluzione satura di cloruro di sodio vengono versati in un cilindro del diametro di 2-3 cm. A parte, mescolare accuratamente 0,5 g di feci in 20-25 ml di acqua e filtrare accuratamente attraverso un imbuto con due strati di garza in un cilindro per soluzione salina, evitando la miscelazione (in modo da formare due strati ben delimitati). Dopo 2-3 ore, lo strato superiore con le feci viene aspirato con una pipetta e la soluzione salina rimanente viene lasciata riposare per 12-20 ore o centrifugata. Il sedimento viene pipettato su un vetrino, coperto con un coprioggetto ed esaminato al microscopio.
Il metodo di Goryachev è stato proposto per rilevare le uova di opistorchide e si è rivelato più efficace dello studio di uno striscio nativo e del metodo Fulleborn. Attualmente, per la diagnosi dell'opistorchiasi (clonorchiasi), i metodi di Kato e Kalantaryan sono raccomandati come abbastanza efficaci e tecnicamente più semplici.
Il metodo di Krasilnikov. Sotto l'influenza dei tensioattivi inclusi nella composizione detersivi(detergenti), le uova di elminto vengono rilasciate dalle feci e concentrate nei sedimenti.
Preparare una soluzione all'1% di detersivo Lotus. Per fare questo, 10 g di polvere vengono sciolti in 1 litro acqua di rubinetto. Se Lotus non è disponibile, è possibile utilizzare altri detersivi, ma è necessario prenderne la quantità necessaria per scioglierli senza formare sedimenti in 1 litro di acqua del rubinetto. 20-30 ml di soluzione detergente vengono versati in un recipiente di vetro con una capacità di 30-50 ml, una piccola porzione di feci viene posta lì e mescolata bene. Il rapporto tra feci e soluzione dovrebbe essere di circa 1:20. Le feci dovrebbero rimanere nella soluzione per almeno 24 ore. Durante questo periodo, sul fondo si forma un sedimento di 2-3 strati. Lo strato inferiore è costituito da particelle grossolane e pesanti, le uova di elminti si raccolgono nello strato intermedio e lo strato superiore è costituito da scaglie grigio-biancastre. Quindi, utilizzando una pipetta, prelevare 2-3 gocce di liquido dallo strato intermedio e trasferirlo su un vetrino. Su un vetrino vengono preparate 2 preparazioni, coperte con un coprioggetto ed esaminate al microscopio.
Il metodo di Krasilnikov consente di rilevare le uova di tutti i tipi di elminti escrete nelle feci.
Metodo di sedimentazione etere-formalina e metodo di sedimentazione chimica con alta efficienza sono molto laboriosi, soprattutto durante gli esami di massa, pertanto è più consigliabile utilizzare il metodo etere-acetico. Permette, dopo ulteriore trattamento del sedimento con reagenti chimici, di ottenere quasi solo uova di elminti, il che rende più facile identificare le piccole uova di trematodi. Questo metodo si è rivelato universale, identificando le uova di tutti elminti intestinali, cisti protozoarie intestinali, può essere utilizzato anche per quantificare l'intensità dell'infestazione.
7 ml di una soluzione di acido acetico al 10% vengono versati in provette da centrifuga graduate e 1 g di feci viene aggiunto fino alla tacca di 8 ml. Le feci vengono accuratamente miscelate con un bastoncino fino a formare una miscela omogenea, quindi filtrate attraverso due strati di garza in un'altra provetta da centrifuga (in modo che la nuova provetta della soluzione filtrata contenga nuovamente 8 ml; se inferiore, è possibile inoltre sciacquare l'imbuto con una benda con una soluzione al 10% di acido acetico, attraverso chi filtra la soluzione fecale). Aggiungere 2 ml di etere in questa provetta (fino alla tacca dei 10 ml), tappare e agitare vigorosamente per 30 secondi. La miscela viene centrifugata a 3000 giri al minuto per 1 minuto (o 2 minuti a 1500 giri al minuto). Lo strato coagulante (sotto forma di tappo nella parte superiore della provetta) viene separato dalle pareti della provetta con un bastoncino e drenato accuratamente insieme al liquido surnatante. Il precipitato (solitamente piccolo, incolore) viene pipettato su vetrini, coperto con un vetrino coprioggetto ed esaminato al microscopio.
Livello iniziale di conoscenze e abilità.
Lo studente deve sapere:
1. Rappresentanti dei trematodi opisthorchis, paragonima, fasciola, dicrocoelium.
2. Cicli vitali, vie di infezione dei trematodi, quadro clinico malattie, durata di conservazione delle feci
Lo studente deve essere in grado di:
1. Identificare le uova di trematodi utilizzando immagini e tabelle.
2. Formare misure preventive.
3. Prepara uno striscio nativo, uno striscio grande, uno striscio di Kato, valuta il tuo lavoro, lavora con un microscopio.
4. Identificare le uova di trematodi nei preparati, rispettare le norme sulla protezione del lavoro e rispettare le norme sanitarie ed epidemiologiche. modalità.
Struttura della lezione:
Parte teorica:
Ø Microlezione.
Parte pratica:
Ø Preparazione di striscio nativo, striscio grande, striscio di Kato, valutazione delle prestazioni, microscopia
Microlezione.
Ritiro e consegna del materiale
La diagnosi finale delle elmintiasi può essere stabilita solo tenendo conto dei risultati degli esami di laboratorio. Il principale metodo di diagnosi di laboratorio delle infezioni da elminti è il rilevamento di uova o larve di elminti nelle feci, nelle urine, nel sangue e in altri fluidi biologici mediante esame microscopico. I materiali per la ricerca sono feci, contenuti duodeno, sangue, espettorato, tessuto sottoposto a biopsia e altri materiali.
La raccolta del materiale per la ricerca viene effettuata in contenitori puliti di vetro o plastica, accompagnati da un'indicazione che indica il nome del soggetto. Durante gli esami di massa è consentito raccogliere le feci in bicchieri di carta cerata o sacchetti di plastica.
Le feci per l'analisi devono essere consegnate al laboratorio entro e non oltre un giorno e, se si sospetta una strongiloidosi, immediatamente dopo la loro escrezione. Se questa regola viene violata, fare una diagnosi dovuta alla distruzione di uova o larve diventa spesso difficile o impossibile.
Per identificare uova e larve di alcuni tipi di elminti, utilizzare metodi speciali: Metodo Bormann, raschiamento perianale, metodo striscio con nastro adesivo, coltura delle larve su carta da filtro (metodo Harada e Mori), ecc.
Parte pratica:
I metodi più comuni per esaminare le feci per la presenza di uova di elminti sono lo striscio nativo, lo striscio spesso sotto cellophane e i metodi dello striscio largo.
Quando si studiano le uova di elminti al microscopio, è consigliabile confrontare immagine visibile con le sue caratteristiche nel determinante delle uova di elminti.
Metodo dello striscio nativo
Attrezzatura:
vetrini;
cuvetta ampia;
matita;
Soluzione acquosa di glicerina al 50% (mescolare parti uguali di glicerina e acqua distillata);
un recipiente con una soluzione di polidi allo 0,5%;
microscopio.
Progresso
1. Posizionare i vetrini in una cuvetta e numerarli.
2. Applicare 2 gocce di una soluzione acquosa di glicerolo al 50% con una pipetta a una distanza di 4 cm l'una dall'altra sui vetrini.
3. Prendi un pezzo di feci con un bastoncino, delle dimensioni di una testa di fiammifero (30-50 mg), aggiungilo a una goccia di glicerina e macinalo fino a ottenere una sospensione uniforme.
4. Su ciascun vetrino vengono preparati due strisci nativi, che non devono fondersi tra loro e non raggiungere i bordi, in modo da non macchiare le dita dell'assistente di laboratorio. Per ogni test vengono utilizzati nuovi bastoncini.
5. Esaminare i preparati, senza coprirli con vetrini coprioggetto, al microscopio (obiettivo 8x, oculare 10-15x).
6. Al termine dello studio, immergere i preparati in un recipiente con una soluzione di polidesi allo 0,5%.
Metodo dello striscio spesso sotto cellophane.
Il metodo è stato proposto da K. Kato, M. Miur nel 1954. Lo striscio è uno strato di feci non diluite su un vetrino, pressato sotto un foglio di sottile cellophane igroscopico impregnato di glicerina.
Riso. Preparare uno spesso striscio sotto cellophane:
a - striscio nativo; b - comprimere un grumo di feci coperto di cellophane con un tappo di gomma; c - macchia spessa sotto cellophane (secondo Yu.A. Berezantsev e E.G. Avtushenko, 1976)
Attrezzatura:
cuvetta ampia;
Strisce di cellophane 22x30 mm trattate con miscela Kato per 24 ore;
Miscela Kato (soluzione al 3% di verde malachite - 6 ml, soluzione al 6% di fenolo - 500 ml, glicerina - 500 ml, 3,5 ml della miscela sono sufficienti per 100 strisce);
grandi tappi di gomma;
pinzette anatomiche;
bastoncini di plastica;
matita;
microscopio.
Progresso
1. Posizionare i vetrini in una cuvetta e numerarli.
2. Raccogliere metà quantità di feci delle dimensioni di un pisello con un bastoncino (50-60 mg) e posizionarla al centro su un vetrino.
3. Rimuovere la striscia di cellophane trattata con Kato dal barattolo con una pinzetta e posizionarla sul campione di feci su un vetrino.
4. Premere il cellophane con un tappo di gomma in modo che le feci siano distribuite uniformemente senza fuoriuscire dai bordi della striscia.
5. Lasciare limpido il preparato per 60 minuti, quindi esaminarlo al microscopio (obiettivo 8-40x, oculare 10x).
6. Al termine dello studio, posizionare il farmaco in un recipiente con una soluzione di polidi allo 0,5%.
7. Rimuovere posto di lavoro, Lavarsi le mani.
Metodo del colpo grande.
Il metodo è stato proposto da Yu.A. Berezantsev e E.G. Avtushenko nel 1973. L'essenza del metodo si basa sull'uso di un microscopio binoculare e uno striscio nativo su vetro 6x9 cm, che consente di esaminare contemporaneamente fino a 200-300 mg di feci.
Attrezzatura:
diapositive 6x9 cm e 7x10 cm;
bastoncini di plastica;
Soluzione di glicerina al 50% (glicerina e acqua distillata in parti uguali);
un recipiente con una soluzione di polidi allo 0,5%;
microscopio;
cuvetta smaltata;
matita.
Progresso
1. Posizionare i vetrini di vetro da 7x10 cm in una cuvetta e numerarli.
2. Quindi posizionare una seconda diapositiva da 6x9 cm sopra ciascuna diapositiva.
3. Pipettare 15-20 gocce di una soluzione di glicerolo al 50% su un vetrino di vetro da 6x9 cm.
4. Prendere pezzi di feci delle dimensioni di un pisello medio (200-300 mg) da punti diversi con un bastoncino e immergerli in una soluzione di glicerolo al 50% su un vetrino.
5. Macinare un pezzo di feci nella glicerina con un bastoncino fino a formare una sospensione uniforme, in modo che l'area che occupa sia di circa 33-34 cm2. Non coprire lo striscio con vetrini coprioggetto.
6. Tenere per i bordi un vetro di copertura grande 7x10 cm con una larga macchia su di esso (per evitare di sporcarsi le dita).
7. Esaminare uno striscio grande con un ingrandimento di 34x (obiettivo 2x, oculare 17x) e 50x (obiettivo 4x, oculare 12,5x). Nei casi dubbi, gli studi vengono effettuati ad alto ingrandimento.
8. Al termine dello studio, posizionare il farmaco in un recipiente con una soluzione di polidi allo 0,5%.
9. Pulisci il posto di lavoro, lavati le mani.
Con questo metodo di ricerca vengono determinate le grandi uova di elminti (nematodi, tricocefali, anchilostomi, ossiuri, tenie, taeniaidi, fasciole). Sembrano un po' diversi e richiedono una certa esperienza per individuarli rapidamente. È possibile utilizzare strisci di grandi dimensioni per testare le uova di schistosomi e le larve di anguilla. Uno striscio grande contiene 6-10 volte più materiale da testare di uno striscio nativo. La sua efficienza è altrettanto molte volte superiore.
Informazioni correlate.
Metodi per la diagnosi di laboratorio intravitale delle elmintiasi:
— studi elmintocoprologici;
— esami elminto-ovoscopici;
— studi elmintolarvoscopici;
— diagnostica immunobiologica;
— sverminazione diagnostica e altri metodi;
Metodi diagnostici post mortem:
— studi patologici;
— dissezioni elmintologiche complete e incomplete di organi e tessuti (PGV e NGV).
Prima di passare alle questioni sopra elencate su questo argomento, ritengo opportuno definire il concetto di “invasione” e di “malattie invasive”.
Le malattie invasive possono manifestarsi sia in forma clinicamente espressa con mortalità significativa, sia in forma nascosta (latente).
Nella diagnosi delle malattie invasive cruciale Avere ricerca di laboratorio, a seguito del quale viene installato l'agente patogeno.
Consideriamo i metodi per la diagnosi intravitale delle elmintiasi. A questo scopo, sia macro che studi microscopici, principalmente feci, urina, sangue, derma, contenuto di cavità corporee, ecc. Questi metodi di studi diagnostici sugli elminti, volti a trovare e studiare gli elminti stessi, i loro frammenti o uova e larve, sono i più conclusivi e ampiamente utilizzati per la diagnosi delle infezioni da elminti.
Il materiale per gli studi diagnostici deve essere esente da impurità e contaminanti estranei, si consiglia di prelevare le feci dal retto dell'animale, devono essere fresche, devono essere conservate al freddo (non > 5 o C), si possono anche conservare con una soluzione di formalina al 5-10% o acido carbolico.
Elmintoscopia– utilizzato per rilevare esemplari interi di elminti o loro frammenti nelle feci, soprattutto durante l’esame delle cestodosi intestinali. Questo metodo viene utilizzato anche per monitorare l'efficacia della sverminazione e per registrare il numero di elminti espulsi. Per questi studi, è necessario prelevare l'intera porzione una tantum di feci e, per tenere conto dell'efficacia della sverminazione, raccogliere tutti gli escrementi espulsi dall'animale entro 2-4 giorni dal trattamento. Le feci raccolte vengono prima esaminate ad occhio nudo. Quindi vengono posti in un recipiente di metallo, diluiti con 5-10 volte la quantità di acqua, mescolati e lasciati riposare per un po' di tempo, quindi lo strato superiore viene drenato (per sedimentare) e viene aggiunta nuovamente acqua. Queste manipolazioni di lavaggio e sedimentazione sequenziali vengono eseguite più volte. Il precipitato risultante viene esaminato in piccole porzioni in cuvette (piastre Petri) su fondo bianco e nero. Tutti gli elminti visibili vengono selezionati con un ago ed esaminati al microscopio, stabilendo la specie.
L'elmintoovoscopia è un metodo per diagnosticare le elmintiasi in seguito al rilevamento delle uova di elminti nel materiale. Per effettuare tali studi si utilizzano le seguenti attrezzature e mezzi: microscopio biologico, vetrini, piastre Petri, bicchieri di vetro o plastica (diametro non > 4-5 cm), bicchieri con un volume di 50 ml, filtri di filtrazione (con un rete di nylon, calza), bacchette di vetro, anse metalliche con diametro dell'anello di 8-10 mm.
Le soluzioni di flottazione vengono utilizzate per studi diagnostici. La migliore capacità di galleggiamento è data dalle soluzioni a una temperatura di 20-22 o C. Controlliamo la densità della soluzione con un densimetro. Una soluzione satura di nitrato tecnico o nitrato di ammonio con una densità di 1,32 (1500 g per 1 litro di acqua bollente); nitrato di sodio o nitrato di sodio con densità 1,38 (rapporto sale/acqua calda 1:1); solfato di magnesio (solfato di magnesio) con una densità di 1,26-1,28 (920 g per 1 litro di acqua calda); tiosolfato di sodio o iposolfito di sodio, densità 1,38-1,40 (1750 g per 1 litro di acqua bollente); solfato di zinco con una densità di 1,24 (400 g per 1 litro di acqua); sale da cucina, densità 1,2 (400 g di sale in 1 litro d'acqua vengono portati all'ebollizione), viene utilizzato freddo.
Il metodo più semplice per l'esame elmintico-ovoscopico delle feci è il metodo dello striscio nativo. Un piccolo pezzo di feci viene posto su un vetrino, vengono aggiunte 2-3 gocce di una miscela di parti uguali di glicerina e acqua, mescolate accuratamente, coperte con un coprioggetto e osservate al microscopio. Questo metodo è inaffidabile, poiché con un'invasione debole dà un risultato negativo.
Metodo di risciacquo sequenziale(metodo di sedimentazione) viene utilizzato per diagnosticare i trematodi negli animali, le cui uova di agenti patogeni hanno un peso specifico elevato e non vengono catturate con il metodo galleggiante. Prendere 5 g di feci, mescolare con 10 volte la quantità di acqua, filtrare attraverso un setaccio o una garza e lasciare filtrare per 5 minuti. Successivamente, il liquido viene drenato e al precipitato viene aggiunta acqua pulita e nuovamente depositata per 5 minuti. Fino a quando il liquido diventa limpido. Il liquido viene drenato e il sedimento viene esaminato al microscopio per la presenza di trematodi.
I metodi di flottazione sono spesso utilizzati per diagnosticare nematodi e cestodi. Il metodo più comune e più utilizzato è il metodo Fulleborn. Per fare questo, prendi 10-20 g di feci, mettilo in un barattolo o un bicchiere con una capacità di 100-200 ml, strofinalo accuratamente con un bicchiere o un bastoncino di legno in una soluzione satura sale da tavola. La quantità totale di soluzione aggiunta dovrebbe essere di circa 20 volte più quantità feci. Quindi filtrare e lasciare agire per 30 minuti. Rimuoviamo la pellicola dalla superficie del liquido sedimentato con un anello metallico e la trasferiamo su un vetrino, lo copriamo con un coprioggetto ed lo esaminiamo al microscopio. Il metodo Shcherbovich viene utilizzato per rilevare le uova con più alta densità(ad esempio uova di metastrongilidi), per le quali viene utilizzata una soluzione satura di solfato di magnesio. Un campione fecale (3-5 g) viene agitato in acqua fino ad ottenere una sospensione uniforme. Filtrare attraverso un colino in una provetta da centrifuga e centrifugare per 1-2 minuti. Strato superiore scolare e aggiungere al precipitato una soluzione satura di solfato di magnesio, mescolare bene e centrifugare nuovamente per 1-2 minuti. Quindi la pellicola superiore viene rimossa con un anello metallico, posta su un vetrino, coperta con un vetrino coprioggetto ed esaminata al microscopio.
Metodo di Kotelnikov e Khrenov. Un campione fecale (3 g) viene posto in un bicchiere e riempito con una piccola quantità di soluzione satura di nitrato di ammonio, agitato con una bacchetta di vetro (legno) e la soluzione viene aggiunta a 50 ml. Filtrare la sospensione in un altro bicchiere e lasciare agire per 10-15 minuti. Utilizzando un'ansa, rimuovere 3-4 gocce dalla superficie, trasferirle su un vetrino ed esaminarle al microscopio a basso ingrandimento. Troviamo uova di nematodi, trichocephalus, esofagostoma, strongyloides, metastrongilidi, neoascaridi, strongilati degli organi digestivi, moniesia e tizaniezia, parascaridae, toxocaris, ecc.
Metodo N.V. Demidov per la diagnosi di fascioliasi. Campione fecale (3 g di pecora, 5 g di bovino bestiame), mettere in un bicchiere, versare una soluzione satura cloruro di sodio, mescolare bene con una bacchetta di vetro, lasciare agire per 15-20 minuti. Le particelle di grandi dimensioni vengono rimosse dalla superficie; si aspira il liquido con una siringa, oppure si scola accuratamente, lasciando circa 20-30 ml, si aggiunge acqua al sedimento fino a riempire il bicchiere, si agita bene, si filtra al setaccio o 1 strato di garza; aspirare nuovamente il liquido lasciando 15-20 ml di sedimento; si versa il sedimento in piccoli bicchieri conici, si lascia per 3-5 minuti, si aspira il liquido e si trasferisce il sedimento su un vetrino, esaminandolo al microscopio a basso ingrandimento.
Metodo caro combina procedure di sedimentazione e flottazione. Le feci vengono mescolate con acqua e centrifugate per 3-5 minuti. Il liquido surnatante viene drenato e il fluido di Darling (glicerolo con una soluzione satura di cloruro di sodio, 1:1) viene aggiunto al precipitato, agitato accuratamente e centrifugato una seconda volta per 3-5 minuti. Utilizzare un anello metallico per rimuovere la pellicola da un vetrino, coprire con un vetrino coprioggetto ed esaminare.
Esistono molti altri metodi di ricerca modificati per rilevare le uova di elminti. Esistono metodi standardizzati di Fulleborn, Shcherbovich e altri: per tutti gli studi vengono prelevate le stesse piastre, i campioni vengono depositati e centrifugati per lo stesso tempo, vengono utilizzate anse dello stesso diametro e il numero di uova nel campo visivo del microscopio o in una goccia della pellicola superficiale viene confrontato prima e dopo il trattamento degli animali, per giudicare l'efficacia della sverminazione effettuata. Il metodo più semplice e accurato è quello proposto da M.Sh Akbaev utilizzando una rete realizzata con pellicola fotografica dopo raggi X. Inoltre, vengono utilizzati studi elminto-ovoscopici quantitativi.
Metodo della tabella. Innanzitutto si versano 56 ml di acqua in un cono da 100 ml e si segna all'esterno a livello del suo menisco. Quindi versare altri 4 ml di acqua e fare un nuovo segno. Si versa l'acqua e si versano 56 ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 N in un pallone tarato e si aggiungono feci sufficienti affinché il livello del liquido raggiunga 60 ml. (4 cm 3 feci), aggiungere 10-15 perle, agitare bene. Subito dopo l'agitazione, prelevare 0,075 ml o 0,1 ml della miscela con una pipetta graduata, applicarla su un vetrino ed esaminarla al microscopio, contando il numero di uova di elminti. Il numero di uova in 1 cm 3 (1 g) di feci, il numero di uova trovato viene moltiplicato per 200 (se sono stati esaminati 0,075 ml della miscela) o per 150 (se 0,1 ml della miscela).
Gli esami elmintolarvoscopici vengono utilizzati per diagnosticare la dittocauulosi, la mulleriosi e altre protostrongiloidiasi, nonché la strongilatosi del tratto digestivo dei ruminanti e la strongiloidosi di vari animali.
Metodo di Berman e Orlov. 10 g di feci vengono posti negli imbuti dell'apparato Baermann su una rete metallica o avvolti in pezzi di garza. Riempire con acqua a temperatura ambiente e lasciare agire per 3-6 ore. Durante questo periodo, le larve escono dal campione nel liquido e scendono attraverso il tubo fino al fondo della provetta. Il liquido dalla provetta viene drenato e aspirato. Dopo l'agitazione, il sedimento viene versato su un vetrino ed esaminato al microscopio a basso ingrandimento. Le larve dei nematodi sono mobili e facilmente rilevabili.
Una modifica semplificata del metodo Berman (secondo Shilnikov). I campioni fecali vengono posti in un bicchiere d'acqua e avvolti in tovaglioli di garza. Dopo 3-6 ore si prelevano i campioni, si lascia sedimentare il liquido per 10-15 minuti, quindi si aspira con una pipetta lo strato limpido di acqua. Una goccia di sedimento viene quindi pipettata su un vetrino per la microscopia.
Metodo di sedimentazione con centrifugazione.(metodo espresso secondo Kotelnikov e altri). 3-5 g di feci vengono posti in provette con acqua (20-25 oC) e centrifugati (1000-1500 giri/min) per 2 minuti. Quindi l'acqua viene drenata e il sedimento, agitato, viene versato su un vetrino ed esaminato per la presenza di larve.
Il metodo di Vaid. Diverse palline di feci di pecore e capre vengono poste su un vetrino o un vetro da orologio e viene aggiunta acqua alla temperatura di 40 o C. Dopo 4 minuti, le palline vengono rimosse e il liquido rimasto sul vetro viene esaminato al microscopio per l'analisi. presenza di larve di nematodi. Scoperto metodi diversi le larve devono essere differenziate.
Analisi del sangue secondo Kulikov. Si prelevano 20 ml di sangue dalla vena giugulare e si aggiungono 2 ml di una soluzione acquosa al 3,8% di citrato di sodio e si lascia agire per 20-25 minuti. Si formano 3 strati: lo strato inferiore è costituito da globuli rossi depositati, lo strato intermedio è costituito da leucociti e larve di nematodi e lo strato superiore è siero. Utilizzando una pipetta sottile, prelevare il contenuto dello strato intermedio, applicarlo a gocce su un vetrino, coprirlo con un vetrino coprioggetto e osservare al microscopio.
Esame del sangue bovino (secondo Steward). Rimuoviamo i peli dalla pelle e disinfettiamo la zona. Usa una pinzetta per tirare indietro la pelle e taglia lo strato superficiale con le forbici curve. Posizionarlo su un vetrino in una goccia di soluzione salina e dividerlo con cura con aghi da dissezione. Il liquido viene esaminato al microscopio.
Studio della pelle del cavallo secondo R.S. Chebotarev. Sul garrese, sulla spalla e in altri punti, selezionare un'area di pelle di 5 cm 2 e disinfettarla con alcool. Afferriamo la pelle in una piega, tagliamo un pezzo di 3-4 mm di spessore e 2-3 cm 2 di area. Le sezioni vengono poste in una provetta riempita con 2-3 ml di soluzione salina e lasciate per alcune ore in termostato a 36-37°C oa temperatura ambiente. Quindi il contenuto della provetta viene versato su un vetro da orologio ed esaminato al microscopio per rilevare larve di onchocercus.
Diagnostica immunobiologica. In pratica usano reazioni allergiche per la diagnosi delle elmintiasi tissutali o delle cosiddette cestodiasi larvali, come l'echinococcosi, la cenurosi, la cisticercosi, nonché dei nematodi come la trichinosi. A questo scopo viene utilizzato un test intradermico. Come antigene si consiglia il liquido delle larve (vescicole) o gli estratti di Trichinella e delle loro larve.
Attualmente grande attenzione concentrarsi sullo sviluppo e sull'uso di reazioni sierologiche utilizzando larve vive di elminti come antigeni. Secondo questo principio, le reazioni di microprecipitazione vengono eseguite sulle larve di nematodi vive nei nematodi, sulle cercarie nei trematodi, sulle oncosfere e sugli scoletti nelle cestodi larvali. Un altro principio delle reazioni sierologiche è associato all'uso di antigeni somatici. Vengono utilizzate reazioni di emoagglutinazione e flocculazione (agglutinazione) con antigeni adsorbiti. Come adsorbenti vengono utilizzati carminio, bentonite e resina sintetica di lattice.
Un tipo di reazione sierologica è: la reazione di scolexoprecipitazione (RSkP), sviluppata da R.S. Schultz e R.G. Ismagilova per la diagnosi di echinococcosi negli ovini. Altre reazioni: RNGA, RZGA, ecc.
La sverminazione diagnostica è un metodo di esame macroelmintoscopico. Si usa in caso di sospetto di moniesiosi, tisanieziosi, avitellinosi dei ruminanti, anoplocefalidosi dei cavalli, taeniasi dei carnivori, drepanidoteniosi degli uccelli acquatici, ascariasis dei maiali, ascariasis dei polli, ecc. ad un piccolo gruppo di animali; Nei casi più sospetti della malattia, viene somministrato un antielmintico appropriato in dose terapeutica o ridotta. Gli animali vengono osservati e tutti gli escrementi vengono controllati per individuare elminti o loro frammenti, che vengono ulteriormente esaminati.
E infine, metodi per studiare altri organi.
Esame delle urine: per dioctofimosi dei reni, capillariasi Vescia. L'urina deve essere prima esaminata macroscopicamente o con una lente d'ingrandimento per verificare la presenza di elminti o dei loro frammenti. L'urina viene diluita a metà con acqua distillata e centrifugata per 2-3 minuti, il liquido viene drenato e il sedimento viene applicato su vetrini ed esaminato.
Esame del contenuto della trachea degli uccelli: in esso sono chiaramente visibili syngamus o ciatostomi, che di solito hanno un colore rosso brillante.
Esame della camera oculare. La diagnosi intravitale della setaria negli occhi dei cavalli e dei bovini viene effettuata mediante esame macroscopico della camera anteriore dell'occhio affetto, dove è possibile vedere la setaria che nuota liberamente (5-10 cm) ed è chiaramente visibile anche attraverso una cornea annebbiata.
Esame di un raschiamento superficiale delle pieghe perianali: si utilizza un bastoncino o un fiammifero inumidito con una soluzione acquosa al 50% di glicerina per raschiare le pieghe perianali dall'interno della radice della coda e dalla zona perineale. Il materiale raschiato viene trasferito su un vetrino in 2-3 gocce di glicerolo (1:1 in acqua), coperto con un coprioggetto ed esaminato al microscopio per la presenza di uova di ossiurato.
Metodi per la diagnosi post mortem delle infezioni da elminti
- studi patologici. Diagnosi post mortem delle infezioni da elminti varie fasi il loro sviluppo negli organi e nei tessuti animali. Il metodo più avanzato di dissezione elmintologica è stato sviluppato da K.I. Skryabi. Esistono autopsie elmintologiche complete e incomplete.
Un'autopsia elmintologica completa è la cosa migliore metodo affidabile, che consente la registrazione sia quantitativa che qualitativa di tutti gli elminti che infestano l'animale.
L'essenza di questo metodo: dopo aver rimosso la pelle dal cadavere, esaminala attentamente tessuto sottocutaneo, quindi apri il baule e cavità addominale e rimuovere tutti i sistemi di organi: digestivo, sistema respiratorio, circolatorio, genito-urinario, ecc.
Gli organi vengono separati ed esaminati separatamente, utilizzando il metodo dei lavaggi sequenziali. Organi parenchimali(fegato, polmoni, pancreas, reni, ecc.) vengono posti in un contenitore separato e trasformati in carne macinata, strappando con le mani o tagliando a pezzetti con un coltello o con le forbici. Successivamente, questi detriti vengono lavati con acqua o soluzione salina utilizzando il metodo dei lavaggi successivi. Il precipitato risultante viene studiato in piccole porzioni, prima in cuvette nere e poi bianche o in piastre Petri su fondo bianco e nero. Grandi elminti vengono selezionati visivamente e quelli piccoli - utilizzando una lente d'ingrandimento portatile con ingrandimento 8-10x. Gli elminti vengono raccolti solo con una spazzola o aghi da dissezione, ma non con una pinzetta o con le dita nepalesi.
L'NPGV è una dissezione elmintologica semplificata, durante la quale solo i singoli elminti con dimensioni distinte vengono rimossi da organi e tessuti. Viene utilizzato anche per ottenere materiale museale.
Ricerca elmintologica di oggetti ambiente esterno. Raccolta, conservazione e spedizione di elminti. Fissazione, colorazione degli elminti e preparazione di micropreparati permanenti da essi. Allestimento di macroallestimenti museali. Diagnostica di laboratorio trematodi. Diagnosi: fascioliasi, dicroceliosi, opisthorchiasis, paramphistomatosi, prostagonymosi degli uccelli, echinostomiasi delle anatre e delle oche.
Molto spesso, l'infezione da elminti si verifica attraverso cibo, acqua e mani non lavate contaminati.
Metodi diretti e indiretti per la diagnosi delle elmintiasi
Ad oggi sono stati sviluppati molti metodi diagnostica elmintiasi, ma tutti possono essere divisi in due grandi gruppi: diretto e indiretto. I metodi diagnostici diretti includono quegli studi che consentono di identificare direttamente gli elminti, i loro frammenti, larve o uova. I metodi indiretti per diagnosticare l'elmintiasi si basano sull'identificazione dei cambiamenti secondari caratteristici di un particolare tipo di elmintiasi.
I metodi diretti più popolari per diagnosticare le elmintiasi sono i metodi di ricerca macro e microelmintoscopici.
Metodi di ricerca macroelmintoscopica
Domande dei lettori
18 ottobre 2013, 17:25 Buon pomeriggio. È da quasi un anno che sento prurito intorno all'ano. Nessuno Dolore. Dimmi chi contattare e cosa potrebbe essere? Grazie
Fai una domandaMetodi di ricerca microelmintoscopica
Metodi immunologici ricerca
La diagnosi di elmintiasi si basa sul rilevamento nel siero del sangue anticorpi specifici all'uno o all'altro elminto. Per la ricerca immunologica vengono utilizzati il metodo dell'emoagglutinazione indiretta, il test di immunoassorbimento enzimatico, l'immunoelettroforesi, l'immunoassorbimento e altri metodi sierologici di analisi del sangue.
I metodi di ricerca immunologica vengono utilizzati per diagnosticare l'alveococcosi, l'echinococcosi, la cisticercosi, l'ascariasi, la schistosomiasi e altre elmintiasi.
Analisi del contenuto biliare e duodenale
Biopsia
Diagnostica dell'elettropuntura
La diagnostica dell'elettropuntura si basa sull'analisi della resistenza della pelle quando irritata da deboli elettro-shock. La diagnostica dell'elettropuntura per sospetta elmintiasi può essere eseguita in due modi: utilizzando il metodo Voll o utilizzando il test di risonanza.
Metodi di ricerca strumentale
Viene eseguito anche per l'elmintiasi ecografia, FEDGS e diagnostica informatica. Questi metodi consentono di determinare l'entità del danno causato dagli elminti e di determinare le condizioni dei singoli organi.
7.7. Metodi per determinare la vitalità delle uova e delle larve di elminti
La vitalità delle uova di elminti è determinata da aspetto, colorando con vernici vitali, coltivazione in condizioni ottimali e la creazione di un campione biologico.
7.7.1. Determinazione della vitalità delle uova o delle larve di elminti in base all'aspettoLe uova di elminti vengono esaminate al microscopio prima a basso ingrandimento, poi ad alto ingrandimento. Nelle uova di elminti deformate e morte, il guscio è strappato o piegato verso l'interno, il plasma è torbido e allentato. Le uova segmentate hanno palline di frantumazione (blastomeri) di dimensioni disuguali, forma irregolare, spesso spostato su un polo. A volte ci sono ovuli anomali che, nonostante le deformità esterne, si sviluppano normalmente. Nelle larve vive dei nematodi, la granularità fine è presente solo nella parte centrale del corpo; mentre muoiono, si diffonde in tutto il corpo, compaiono grandi vacuoli ialini lucenti, i cosiddetti "fili di perle".
Per determinare la vitalità delle uova mature di nematodi, tricocefali, ossiuri, i movimenti attivi delle larve dovrebbero essere causati riscaldando leggermente il farmaco (a una temperatura non superiore a 37 ° C). È più conveniente osservare la vitalità delle larve di ascaridi e tricocefali dopo che sono state isolate dal guscio dell'uovo premendo sul vetro di copertura del preparato con un ago da dissezione o una pinzetta.
Nelle larve invasive di nematodi, si vede spesso una guaina staccarsi all'estremità della testa, e nelle larve di tricocefali che hanno completato lo sviluppo nell'uovo, in questo punto si trova uno stiletto ad alto ingrandimento. Nelle larve morte di elminti, indipendentemente dalla loro posizione (nell'uovo o al di fuori di esso), si nota la decomposizione del corpo. In questo caso la struttura interna della larva diventa squadrata o granulare e il corpo diventa torbido e opaco. I vacuoli si trovano nel corpo e le rotture si trovano sulla cuticola.
La vitalità delle oncosfere taeniidi (bovina, tenia di maiale, ecc.) è determinata dal movimento degli embrioni quando esposti ad esse enzimi digestivi. Le uova vengono poste su un vetro da orologio con succo gastrico cani o succo duodenale artificiale. La composizione di quest'ultimo: pancreatina - 0,5 g, bicarbonato di sodio - 0,09 g, acqua distillata - 5 ml. I bicchieri da orologio con le uova vengono posti in un termostato a 36 - 38 ° C per 4 ore. In questo caso, gli embrioni vivi vengono liberati dalle loro membrane. Anche i gusci delle oncosfere viventi si dissolvono in pepsina acidificata e in soluzione alcalina trypsin dopo 6 - 8 ore in termostato a 38°C.
Se si mettono le uova di teniid in una soluzione all'1% di solfuro di sodio o in una soluzione al 20% di ipocloruro di sodio, o in una soluzione all'1% di acqua clorata a 36 - 38 ° C, gli embrioni maturi e vivi vengono rilasciati dalle membrane e non lo fanno cambiare durante 1 giorno. Le oncosfere immature e morte si restringono o si gonfiano e si allargano notevolmente, quindi si “dissolvono” entro 10 minuti o 2 ore. Gli embrioni taeniidi viventi si muovono attivamente anche in una miscela di soluzione di cloruro di sodio all'1%, soluzione di bicarbonato di sodio allo 0,5% e bile a 36 - 38 °C.
La vitalità dell'Adolescaria fascioli raccolta su piante e altri oggetti di corpi idrici viene verificata esaminandoli su un vetrino in soluzione fisiologica al microscopio con stadio di riscaldamento. Quando le larve dei trematodi vengono riscaldate, iniziano a muoversi.
Per determinare la vitalità delle uova di tenia nana, il metodo più semplice è quello di N.S. Ionina: nelle uova vive, la coppia mediana di uncini embrionali è parallela a quelle laterali, oppure queste ultime formano un angolo con la mediana alla base inferiore a 45°. Nelle uova morte, le coppie laterali formano con la coppia mediana alla base un angolo superiore a 45°, oppure gli uncini sono sparsi in modo casuale (si perde la loro disposizione accoppiata); A volte l'embrione si restringe e si formano dei granuli. Un metodo più accurato si basa sulla comparsa di movimenti dell'oncosfera durante un brusco cambiamento di temperatura: da 5 - 10 ° a 38 - 40 ° C.
La determinazione della vitalità delle uova immature di nematodi deve essere studiata in una camera umida (piastre Petri), ponendo le uova di nematodi in una soluzione di formaldeide al 3% preparata in una soluzione isotonica di cloruro di sodio ad una temperatura di 24 - 30 ° C, le uova di tricocefali in una Soluzione al 3%. di acido cloridrico ad una temperatura di 30 - 35 ° C; uova di ossiuri in una soluzione isotonica di cloruro di sodio alla temperatura di 37 °C. Le piastre Petri dovrebbero essere aperte 1 - 2 volte a settimana per una migliore aerazione e la carta da filtro dovrebbe essere nuovamente bagnata acqua pulita.
Le osservazioni sullo sviluppo delle uova di elminti vengono effettuate almeno 2 volte a settimana. L'assenza di segni di sviluppo entro 2 - 3 mesi indica la loro non vitalità. I segni dello sviluppo delle uova di elminti sono le prime fasi di frantumazione, dividendo il contenuto dell'uovo in blastomeri separati. Durante i primi giorni si sviluppano fino a 16 blastomeri, che passano al secondo stadio: morula, ecc.
Le uova di anchilostoma vengono coltivate in un cilindro di vetro (50 cm di altezza e 7 cm di diametro) chiuso con un tappo. Una miscela di volumi uguali di sabbia sterile, carbone e le feci con uova di anchilostoma, diluite con acqua fino a ottenere una consistenza semiliquida, vengono accuratamente versate sul fondo del cilindro utilizzando un tubo di vetro. Durante 1 - 2 giorni di decantazione al buio ad una temperatura di 25 - 30 ° C, le larve rabditiformi si schiudono dalle uova, e dopo 5 - 7 giorni diventano filariformi: le larve strisciano lungo le pareti del cilindro, dove si trovano visibile anche ad occhio nudo.
Le uova di trematodi che si sviluppano naturalmente nell'acqua, ad esempio opisthorchis, diphyllobothriidae, fasciolae e altri, vengono poste su un vetro da orologio, una piastra Petri o un altro recipiente e viene versato un piccolo strato acqua ordinaria. Quando si coltivano le uova di Fasciola, si deve tenere presente che si sviluppano più velocemente al buio, mentre nelle uova vive ad una temperatura di 22 - 24 ° C il miracidium si forma in 9 - 12 giorni. Quando si esamina al microscopio lo sviluppo delle uova di trematodi, i movimenti del miracidio sono chiaramente visibili. Il Miracidium fasciola emerge dal guscio dell'uovo solo alla luce.
Metodo Fulleborn. Le larve di anchilostomi e strongili vengono coltivate su agar in una capsula Petri con carbone animale. Dopo essere state mantenute in un termostato a una temperatura di 25 - 30 ° C per 5 - 6 ore, le larve strisciano attraverso l'agar, lasciando dietro di sé una scia di batteri.
Metodo Harada e Mori. Aggiungere 7 ml di acqua distillata alle provette posizionate su un rack. Utilizzando un bastoncino di legno, prelevare 0,5 g di feci e fare uno striscio su carta da filtro (15 x 150 mm) a 5 cm dal bordo sinistro (questa operazione viene eseguita su un foglio di carta per proteggere la superficie del banco da laboratorio). Quindi la striscia con lo striscio viene inserita nella provetta in modo che l'estremità sinistra libera dallo striscio raggiunga il fondo della provetta. Copri l'estremità superiore con un pezzo di cellophane e avvolgilo saldamente con un elastico. Sulla provetta è scritto il numero e il cognome della persona in esame. In questo stato le provette vengono conservate per 8 - 10 giorni ad una temperatura di 28 °C. Per studiare le larve, rimuovere il coperchio di cellophane e rimuovere una striscia di carta da filtro con una pinzetta. In questo caso è necessario prestare attenzione poiché un piccolo numero di larve infettive potrebbe spostarsi verso estremità superiore carta da filtro o alla parete della provetta e penetrare sotto la superficie del cellophane.
Le provette vengono poste in un bagno di acqua calda a 50 °C per 15 minuti, dopodiché il contenuto viene agitato e versato rapidamente in una provetta da 15 ml per far sedimentare le larve. Dopo la centrifugazione, il surnatante viene rimosso e il sedimento viene trasferito su un vetrino, coperto con un vetrino coprioggetto ed esaminato al microscopio a basso ingrandimento.
Per diagnosi differenziale larve filariformi, è necessario utilizzare i dati nella Tabella 3.
Tabella 3
DIAGNOSTICA DIFFERENZIALE DELLE LARVE FILARIOIDI DI A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, TRICHOStrONGYLUS SP.
| Larve | Dimensioni | Segni caratteristici |
| A. duodenale | Lunghezza del corpo circa 660 µm, lunghezza della guaina - 720 nm | La striatura del cappuccio è meno pronunciata, la protrusione orale è meno evidente, l'estremità anteriore del corpo (ma non il cappuccio) è smussata, il diametro del tubo intestinale è inferiore al bulbo esofageo, l'estremità caudale è smussata |
| N. americano | Lunghezza del corpo circa 590 micron, lunghezza della guaina - 660 nm | Il cappello è notevolmente striato, soprattutto nella parte caudale del corpo, la protuberanza orale appare scura, l'estremità anteriore del corpo (ma non il cappello) è arrotondata come un'estremità stretta uovo di pollo, la parte anteriore del tubo intestinale ha lo stesso diametro del bulbo esofageo, l'estremità caudale è nettamente appuntita |
| S. stercoralis | Lunghezza del corpo circa 500 micron | La larva è priva di guaina, l'esofago è lungo circa la metà del corpo, la coda è smussata o ramificata |
| Trichostrongylus sp. | Lunghezza del corpo circa 750 µm | Il lume intestinale non è dritto, ma a zigzag, l'estremità della coda è arrotondata e ha la forma di un bottone |
I tessuti morti nella maggior parte dei casi percepiscono le vernici più velocemente di quelli vivi. Queste caratteristiche vengono utilizzate in elmintologia per determinare la vitalità delle uova e delle larve di elminti. Tuttavia, in alcuni casi, alcune vernici sono percepite meglio dai tessuti vivi che da quelli morti.
Per distinguere tra uova e larve vive e morte, vengono utilizzati i seguenti colori e metodi.
Il blu di metilene leucobase viene spesso utilizzato per colorare i tessuti vivi e morti. Cellula vivente oppure il tessuto riduce il blu di metilene in leucobase incolore, il tessuto morto non ha questa capacità, quindi acquisisce colore.
Il criterio per la condizione di un uovo è la colorazione dell'embrione, ma non il guscio. Questa capacità è associata alle condizioni in cui l'uovo muore. Nei casi in cui la membrana fibrosa di un ovulo morto non perde le sue proprietà semipermeabili, non permetterà il passaggio dei coloranti e quindi l'embrione morto non verrà colorato. Un embrione colorato indica sempre la morte dell'ovulo.
Per colorare le uova degli ascaridi, è possibile utilizzare il blu di metilene in una soluzione di acido lattico con alcali caustici (0,05 g blu di metilene, 0,5 g di idrossido di sodio, 15 ml di acido lattico). Le uova vive non percepiscono il colore; sono dipinti Colore blu embrioni di uova morte. Le larve di Ascaris vengono colorate con una soluzione basica di vernice blu brillantecresilico ad una concentrazione di 1:10000. nel seguente modo: una goccia di liquido con uova di ascaridi e una goccia della soluzione di vernice principale vengono applicate su un vetrino. La preparazione viene coperta con un coprioggetto, che viene premuto saldamente sul vetrino picchiettando leggermente con un ago da dissezione. Il numero delle larve emergenti e il grado della loro colorazione si osservano al microscopio; dopodiché lo stesso farmaco viene nuovamente esaminato dopo 2 - 3 ore. Sono considerate vive solo le larve indeformate che non si colorano per 2 ore. Le larve morte non emergono dalle uova o si colorano quando il guscio si rompe (parzialmente o completamente).
Quando si determina la vitalità delle uova di nematodi aviari, è possibile colorare i preparati con una soluzione alcolica al 5% di iodio. Quando viene applicato al preparato, i germi delle uova morte di Ascaridia compaiono entro 1 - 3 secondi. sono dipinti colore arancione.
Uova morte di Opisthorchis e oncosfera tenia bovina sono colorate con una soluzione di blu di toluidina (1:1000), e le oncosfere morte di tenia bovina sono colorate con una soluzione di blu cresile brillante (1:10000). Allo stesso tempo, gli embrioni e i gusci delle uova morte e vive acquisiscono colore. Pertanto, dopo la colorazione, le uova e le oncosfere vengono lavate acqua pulita e colorarli inoltre con safranina (diluito 1:10000 in alcool a 10 °C). L'alcol rimuove la vernice dai gusci e la safranina li fa diventare rossi. Di conseguenza, le uova vive diventano rosse; le uova con embrioni morti diventano blu, ma il guscio rimane rosso. Gli embrioni morti di oncosfere di tenia bovina rapidamente, in pochi minuti, diventano rosso vivo o colore rosa safranina o blu cresile blu brillante alla diluizione 1:4000, oppure carminio indaco alla diluizione 1:1000 - 1:2000. Gli embrioni viventi non cambiano sotto l'influenza di queste vernici anche dopo 2 - 7 ore.
Per determinare la vitalità delle uova di tenia nana, si consiglia di utilizzare le seguenti vernici:
1. Blu creasile brillante (1:8000) - dopo 1 ora, l'oncosfera delle uova morte diventa particolarmente colorata, che risalta nettamente sullo sfondo pallido o incolore del resto dell'uovo.
2. Safranina (1:8000 se esposto per 2 ore e 1:5000 per 3 - 5 ore).
3. Soluzione al 50% di acido pirogallico in una diluizione di 1:2 - se esposto per 1 ora ad una temperatura di 29 - 30 ° C (più bassa è la temperatura, più lungo sarà il processo di tintura).
7.7.3. Metodo luminescente per lo studio delle uova e delle larve di elmintiLa microscopia a fluorescenza consente di distinguere tra oggetti vivi e morti senza danneggiare l'uovo. Non utilizzato per la fluorescenza raggi ultravioletti, e la parte blu-viola della luce visibile, con un microscopio convenzionale e vetrini; All'illuminatore OI-18 viene aggiunto uno speciale set di filtri colorati.
Vivo e uova morte nematodi, ossiuri, tenie nane, tenie bovine, tenie larghe e altri elminti emettono fluorescenza in modo diverso. Questo fenomeno si osserva sia durante la luminescenza primaria senza l'uso di coloranti, sia durante la colorazione con fluorocromi (arancio di acridina, corifosfina, primulina, aurolina, berlerin solfato, tripaflavina, rivanolo, acrina, ecc.).
Le uova di nematodi incolori, vive e non segmentate brillano di un verde brillante con una sfumatura giallastra; nelle uova morte il guscio emette una luce verde molto più brillante della parte embrionale verde scuro; Nelle uova dei nematodi con una larva appare solo il guscio e nelle uova morte sia il guscio che la larva sono di colore giallo brillante.
Le uova vive non pigmentate e non segmentate di ossiuri e tenie nane emettono una luce giallo-verdastra; il guscio delle uova morte brilla intensamente sullo sfondo di una massa embrionale verde scuro.
Con la luminescenza secondaria (quando colorato con arancio di acridina ad una diluizione di 1:10.000 e 1:50.000 da 30 minuti a 2 ore), il guscio di nematodi, trematodi e cestodi vivi e morti si illumina in modo diverso.
I gusci delle uova vive e morte di nematodi, toxocara, ossiuri, tenie nane, tenie di ratto, tenie di toro e tenie sono di colore rosso-arancione. Gli embrioni di uova vive di nematodi, toxascaris, tenie di ratto, tenie larghe e oncosfere di tenie bovine fluorescenti in un colore verde scuro opaco o grigio-verde. Le uova embrionali morte di questi elminti emettono un colore rosso-arancio “ardente”. Le larve vive di ossiuri e toxocara (gusci d'uovo liberati) emettono una luce grigio-verde opaca; quando muoiono, il colore cambia dall'estremità della testa ad un verde chiaro “ardente”, poi giallo, arancione e infine arancione brillante.
Se colorate con fluorocromi - coryphosphylum, primulin, le uova morte di nematodi e tricocefali mostrano un bagliore dal giallo lilla al rosso rame. Le uova vitali non si illuminano, ma sono colorate colore verde scuro.
Le uova vive di trematodi (paragonimus e clonorchis) non si illuminano quando vengono colorate con l'arancio di acridina, ma le uova morte producono un colore verde-giallastro.
Il metodo della luminescenza può essere utilizzato anche per determinare la vitalità delle larve di elminti. Pertanto, le larve di strongilato e rabditatus fluorocromate con una soluzione di arancio acridina (1:2000) brillano: quelle vive - verdi (con una tinta), quelle morte - con una luce arancione brillante.
I miracidi viventi che emergono dal guscio emettono una fioca luce bluastra con una corolla di ciglia giallo chiaro appena percettibile, ma 10-15 minuti dopo la morte appaiono con un brillante verde chiaro "ardente", e poi una luce rosso-arancione.
7.7.4. Metodo del campione biologicoAd esempio, per determinare la vitalità delle uova di ascaridi (ascaridi di maiale, ascaridi umani, Toxocara, Toxascaris, ecc.) per animale (cavie, topi) sono necessarie almeno 100 - 300 uova con larve sviluppate. Le uova di Ascaris in una soluzione isotonica di cloruro di sodio vengono pipettate attraverso la bocca di un topo o di una cavia. Dopo 6-7 giorni l'animale viene macellato, il suo fegato e i suoi polmoni vengono aperti ed esaminati separatamente per verificare la presenza di larve di ascaridi. A tale scopo, il fegato e i polmoni vengono tagliati in piccoli pezzi con le forbici ed esaminati con il metodo Berman o Supryaga (sezione 6.1.2).
Se gli animali sono stati infettati con uova invasive vive, all'autopsia si trovano larve di ascaridi migranti nel fegato e nei polmoni.
In caso di infezione, le uova di Fasciola nelle feci degli animali da laboratorio possono essere rilevate nei conigli dopo 2 mesi, nel porcellini d'India- dopo 50 giorni, nei topi - dopo 35 - 40 giorni.
Per ottenere più rapidamente una risposta, gli animali da laboratorio vengono aperti dopo 20 - 30 giorni e il fegato viene esaminato per la presenza di giovani fascioli.
Per determinare la vitalità delle uova di tenia nana, si consiglia anche di somministrarle a topi bianchi precedentemente non infetti, quindi aprire gli animali dopo 92-96 ore e identificare i cisticercoidi nei villi intestinali o i cestodi nel lume intestinale.
Per determinare la vitalità delle uova di Opisthorchis, si raccomanda un metodo (German S.M., Baer S.A., 1984), basato sull'attivazione fisico-chimica della ghiandola da cova del miracidium e sulla stimolazione attività motoria larve, che porta all'apertura del cappuccio dell'uovo e al rilascio attivo di miracidium in condizioni sperimentali.
La sospensione delle uova di Opisthorchis in acqua viene preraffreddata a 10 - 12 °C (tutte le operazioni successive vengono effettuate a temperatura ambiente 19 - 20 °C). 1 goccia di sospensione contenente 100 - 150 uova viene aggiunta ad una provetta da centrifuga. La provetta viene posta in un supporto per 5 - 10 minuti. Durante questo periodo tutte le uova riescono ad affondare sul fondo. Quindi l'acqua in eccesso viene accuratamente aspirata con una striscia di carta da filtro e nella provetta vengono aggiunte 2 gocce di un mezzo speciale. Il terreno viene preparato in tampone Tris-HCl 0,005 M; al tampone si aggiunge una soluzione di etanolo al 12 - 13% ed un colorante (fucsina, safranina, eosina, blu di metilene, ecc.). La provetta viene agitata, il suo contenuto viene pipettato su un vetrino e lasciato per 10 minuti, agitando leggermente. Quindi aggiungere 2 gocce del mezzo specificato. Il preparato è pronto per l'esame al microscopio con un microscopio ottico convenzionale con ingrandimento 20x.
Durante questo periodo, il coperchio delle larve vitali si apre e il miracidium esce attivamente nell'ambiente specificato. Grazie alla presenza di etanolo al suo interno, vengono immobilizzati dopo 2 - 5 minuti e poi verniciati con un colorante. Possono essere facilmente rilevati e contati al microscopio.
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